Dent病藥物治療臨床觀察及CLCN5突變表達(dá)載體構(gòu)建.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一部分 15例Dent病患兒臨床特征分析及枸櫞酸鉀聯(lián)合氫氯噻嗪及ACEI類藥物治療的長期臨床觀察
　　目的:
　　總結(jié)我院隨訪的15例Dent病患兒的臨床特征，并分析其與基因型之間的相關(guān)性;探討給予枸櫞酸鉀聯(lián)合氫氯噻嗪及腎素血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)治療的患兒的藥物療效，為Dent病的藥物治療提供臨床經(jīng)驗(yàn)。
　　方法:
　　選取2006年7月至2014年3月診

2、斷為Dent病的患兒。根據(jù)尿蛋白、尿鈣及血鉀水平，給予枸櫞酸鉀聯(lián)合氫氯噻嗪及ACEI類藥物治療。比較分析其治療前后各項(xiàng)指標(biāo)的變化。主要觀察指標(biāo)包括:尿蛋白、尿鈣、腎功能、血清肌酶、腎臟超聲、骨密度等。
　　結(jié)果:
　　1.共有15例男性患兒納入研究，發(fā)病年齡3月～11歲，平均(2.62±3.11)歲，病程0.5年～9.5年，平均（2.81±2.34）年，均存在低分子蛋白尿(LWMP)及高鈣尿，3例存在血尿。治療前15例中:4

3、例肌酶升高;10例患兒行腎活檢，結(jié)果為:輕微病變7例，局灶性球性腎小球硬化(FGGS)1例，輕度系膜增生性IgA腎病1例，系膜增生性IgM腎病伴腎小管間質(zhì)損傷1例;5例存在腎臟鈣化灶，1例存在腎臟結(jié)石;3例存在身材矮小;5例存在骨質(zhì)疏松;10例患兒行基因檢測(cè)，6例CLCN5突變，1例OCRL1突變，3例未發(fā)現(xiàn)基因突變。
　　2.對(duì)15例患兒進(jìn)行了0.5～7.5年的隨訪，平均隨訪時(shí)間為(3.61±2.26)年。至隨訪結(jié)束時(shí)，15例患

4、兒給予枸櫞酸鉀治療，平均劑量(0.16±0.12) g/kg·d;11例患兒聯(lián)合氫氯噻嗪治療，平均劑量(0.75±0.41) mg/kg·d，另4例因隨訪期間尿鈣控制可而逐漸停用氫氯噻嗪;13例患兒聯(lián)合貝那普利治療，平均(0.17±0.06) mg/kg·d，2例患兒因隨訪期間出現(xiàn)低血壓（血壓＜80/50mmHg）而停用藥物。
　　3.治療效果:治療前后，尿鈣/肌酐差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.41±0.19mg/mgVS0.26±0

5、.12mg/mg，P=0.021），24小時(shí)尿鈣定量的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（6.76±2.0mg/kg Vs4.34±1.97 mg/kg，P=0.000）。24小時(shí)尿蛋白定量的差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.96±0.62g/24h VS0.87±0.44g/24h，P=0.327）。治療前后，尿蛋白比例均以小分子蛋白為主。治療后:原有3例血尿患兒仍存在血尿，未見加重;3例存在肌酶升高，1例恢復(fù)正常;2例重復(fù)腎活檢，結(jié)果分別為輕微病變及局灶

6、性腎小球腎炎伴腎小管間質(zhì)損傷;腎臟超聲示:原有1例腎結(jié)石患兒超聲顯示結(jié)石消失，5例存在腎臟鈣化灶患兒治療后腎臟鈣化灶消失;4例存在骨質(zhì)疏松，1例治愈;原有3例存在身材矮小者，1例生長激素治療后身高追至第10百分位線，其余2例仍存在身材矮小，另有1例于隨訪1.25年后診斷為身材矮小。治療前后，患兒血肌酐及腎小球?yàn)V過率(GFR)均正常。
　　4.15例患兒中4例口服氫氯噻嗪后出現(xiàn)低鉀血癥，2例口服貝那普利后出現(xiàn)低血壓。
　　結(jié)論

7、:
　　1.本組合并大量蛋白尿的Dent病患兒，腎活檢未見局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)。
　　2.6例CLCN5基因突變者臨床表型及基因型未發(fā)現(xiàn)明顯相關(guān)性。
　　3.確診為Dent病的患兒，給予枸櫞酸鉀聯(lián)合氫氯噻嗪及ACEI類藥物治療可明顯降低尿鈣排泄水平，長期治療可使腎臟結(jié)石及鈣化灶消失。
　　4.本隨訪中給予的貝那普利在降尿蛋白水平上作用不明顯，且低分子蛋白尿無明顯改善。
　　5.給予氫氯噻嗪類藥物

8、及ACEI類藥物治療時(shí)，需嚴(yán)密監(jiān)測(cè)血鉀及血壓水平，如出現(xiàn)低鉀血癥和低血壓時(shí)應(yīng)及時(shí)給予處理。
　　第二部分 CLCN5基因及2個(gè)突變體表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建
　　目的:
　　我們發(fā)現(xiàn)2個(gè)新的基因突變，L594fsX595和IVS4-2A＞G，目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。為探索其突變后的功能變化，我們?cè)O(shè)計(jì)通過全基因合成技術(shù)，構(gòu)建1個(gè)野生型和2個(gè)突變型電壓門控性氯離子通道蛋白5基因(CLCN5)真核表達(dá)載體系統(tǒng)，為研究Dent病的發(fā)病機(jī)制

9、提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　首先通過全基因合成技術(shù)將正常CLCN5基因和2個(gè)CLCN5基因突變體的基因序列從細(xì)胞文庫中擴(kuò)增，在證實(shí)3個(gè)基因序列正確后，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ，EcoRⅠ將目的基因片段酶切后與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)/EGFP/IRES連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，最后成功構(gòu)建pcDNA3.1(+)/EGFP/IRES-CLCN5、pcDNA3.1(+)/EGFP/IRES-c.2073delGCLC

10、N5及pcDNA3.1(+)/EGFP/IRES-wS4-2A＞GCLCN5共3個(gè)真核表達(dá)載體系統(tǒng)。
　　結(jié)果:
　　構(gòu)建的突變體經(jīng)DNA直接測(cè)序顯示存在CLCN5基因L594fsX595剪切突變和IVS4-2A＞G無義突變。提取轉(zhuǎn)化后培養(yǎng)陽性菌落中的質(zhì)粒，將DNA溶液送檢基因測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示基因序列比對(duì)正確，載體構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:
　　pcDNA3.1(+)/EGFP/IRES-CLCN5、pcDNA3.