高發(fā)區(qū)（大連）胃癌發(fā)病分子基礎的探討.pdf

1、目的： 胃癌是我國最常見的、同時也是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均較高的消化道惡性腫瘤之一。由于起病隱蔽，臨床病人多為晚期患者，死亡率高居全球惡性腫瘤死亡率的第二位。其發(fā)生具有多因素、多步驟、多基因和多途徑的特點。目前對胃癌缺乏準確有效的早期診斷方法是造成胃癌高死亡率的主要原因。因此深入了解胃癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機制，制訂預測、早期診斷和早期阻斷的有效措施尤為重要。 大連地區(qū)是胃癌高發(fā)區(qū)，具有比較特殊的地理地貌特點以及生態(tài)學環(huán)

2、境。本地居民也有獨特的生活飲食習慣和相對封閉的遺傳學背景。而這些環(huán)境因素和遺傳因素都在胃癌的發(fā)生過程中發(fā)揮作用，針對這些因素的流行病學調(diào)查將有助于我們進一步加深對胃癌發(fā)生的分子生物學機制的理解。研究大連地區(qū)胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的分子改變及周圍環(huán)境的影響有助于人們深入認識胃癌在該地區(qū)的發(fā)生機制，對于制定胃癌的預防，早期診斷和治療策略具有重要的意義。 環(huán)境中的化學致癌物多為間接致癌物，即致癌物前體。它們在細胞內(nèi)經(jīng)過代謝活化后才具有致癌

3、活性。細胞色素P450就是催化此類代謝活化反應的一組氧化酶。它們分布于多種臟器主質(zhì)細胞的滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，主要負責包括環(huán)境致癌物在內(nèi)的外源性化合物的代謝解毒與活化。某些活化產(chǎn)物能夠損傷生物大分子或形成DNA加合物進而激活原癌基因?qū)е掳┌Y發(fā)生。研究表明，大多數(shù)已知的環(huán)境化學致癌物都是CYP450的作用底物。 CYP1A1基因是P450超基因家族中的一個重要成員。它可以被多種內(nèi)、外源性多環(huán)芳烴類化合物如苯并芘誘導表達。其基因產(chǎn)物為芳烴羥

4、化酶，可將多環(huán)芳烴類化合物代謝活化為環(huán)氟類化合物而進一步發(fā)揮致癌、致突變作用。有關(guān)CYP1A1表達在多階段胃癌發(fā)生中的作用少見報道。鑒于大連地區(qū)人群有進食含有過量致癌物前體食品的習慣，我們對本地區(qū)胃癌組織中CYP1Al的表達特點及其與多階段胃癌發(fā)生的關(guān)系加以分析：同時對CYP1Al基因表達調(diào)控機制以及大連地區(qū)人群CYP1Al基因多態(tài)性分布進行了研究。 我們在前期工作中發(fā)現(xiàn)了大連地區(qū)胃癌COX-2基因啟動子區(qū)域異常甲基化導致的CO

5、X-2基因的表達缺失。這一現(xiàn)象雖然和以往的許多研究結(jié)果有所不同，但是我們認為其含義深遠，即它強烈地提示我們大連地區(qū)胃癌的高發(fā)機制可能與其他地區(qū)胃癌的發(fā)生機制不同——主要依賴于一種異常甲基化的表觀遺傳學改變途徑，這可能是大連地區(qū)胃癌發(fā)病率高的始因。而這種表觀遺傳學改變與大連地區(qū)特殊的環(huán)境因素及本地區(qū)人群遺傳背景有關(guān)。 表觀遺傳學改變是一種未涉及DNA序列變化的基因外調(diào)控機制，主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾等。其中DNA甲基化是目

6、前人們研究最為深入的一種表觀遺傳學修飾方式，主要發(fā)生在CpG二核苷酸序列的胞嘧啶上，并證實與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。DNA甲基化的可誘導性和可逆性特點也為腫瘤發(fā)生機制探討和腫瘤治療提供了新的思路。結(jié)合大連地區(qū)地理流行病學特點以及生活飲食習慣，飲食中的許多成分都被證實是促甲基化劑。因此對本地區(qū)胃癌患者以及正常對照人群多基因多位點的DNA甲基化特點(也稱CpG島甲基化表型，CpG Island　Methylator Phenotype，CI

7、MP)比較分析就顯得尤為有意義。不僅可以發(fā)現(xiàn)胃癌患者的CIMP型特征，而且可以判斷未患個體的甲基化易感性，進而預測個體發(fā)病風險。為本地區(qū)胃癌的預防、預測和早期診斷提供理論指導。 我們的研究目的在于通過檢測特定區(qū)域腫瘤、癌前病變、癌旁相對正常以及、非癌正常對照胃粘膜組織的遺傳學和表觀遺傳學改變，判斷遺傳因素和環(huán)境因素在腫瘤發(fā)生過程中的作用及相互聯(lián)系。探討大連胃癌高發(fā)區(qū)胃癌發(fā)病機制，為胃癌臨床早期診斷、預防乃至治療方法的選擇提供新的

8、依據(jù)和思路。 方法： 全部標本來自大連醫(yī)科大學遼寧省(高校)癌癥基因組重點實驗室建立的人胃癌組織庫。在冰凍組織微陣列技術(shù)和定點捕獲技術(shù)基礎上，應用免疫組化、RT-PCR、酶活性分析、Western蛋白印跡分析、PCR-SSCP、RFLP-PCR以及MS-PCR等方法，分別對不同病變胃粘膜組織和癌旁相對正常組織中CYP1Al基因表達特點進行分析，并對其基因表達調(diào)控機制如AhR基因共表達及核易位以及該基因Msp I和Exon

9、7多態(tài)性與腫瘤易感性的關(guān)系進行探索；同時應用甲基化特異性PCR檢測了5個常用CIMP鑒定位點以及與胃癌的惡性表型密切相關(guān)的CDH1基因5’啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件包應用Kruskal-Wallis和Mamm Whitney檢驗方法進行統(tǒng)計分析。 結(jié)果： 一.CYP1A1基因在不同病變胃粘膜組織中的表達情況免疫組化結(jié)果顯示：在癌旁相對正常、癌前病變以及胃癌組中，CYP1A1基因表達率分別為11

10、.1％(1/9)，60％(12/20)和86.0％(37/43)，組間差別顯著，具有統(tǒng)計學意義(p<0.005)。RT-PCR.和Western印跡雜交結(jié)果基本與之符合。 二. AhR基因在不同病變胃組織中的表達與核易位特點在39例胃癌樣本中，有37例AhR基因表達，同時這37例樣本都發(fā)生了AhR蛋白的核內(nèi)表達(核易位)，總陽性率和核易位率均為94.9％(37/39)；在6例癌旁相對正常胃粘膜組織標本中，有3例表現(xiàn)為弱陽性(+)

11、，陽性率為50％，其中只有l(wèi)例發(fā)生核易位，核易位率僅為16.7％(1/6)。計數(shù)資料統(tǒng)計學檢驗結(jié)果顯示：不同病變胃粘膜組織(胃癌和癌前病變)中的AhR基因表達水平要明顯高于癌旁相對正常組織(p<0.05)；AhR蛋白的核內(nèi)表達(核易位)在與CYP1A1基因的高表達存在正相關(guān)(rs=0.437，p<0.01)。 三.CYP1A1基因多態(tài)性分析1、MspI多態(tài)性分析在胃癌組中，m1m1、m1m2和m2m2基因型頻率分別為43.3％、

12、45％和11.7％；在正常對照組為45.6％、49.1％和5.3％。兩組間基因頻率差別無統(tǒng)計學意義，從而證明CYP1A1基因的MspI多態(tài)性與胃癌易感性無顯著相關(guān)性。 2、Exon 7多態(tài)性分析胃癌組Ile/Ile、Ile/Val Val/Val基因型頻率分別為Ile/Ile型26.7％、50％和23.3％；正常對照組為52.6％、28.1％和19.3％。同樣，組間基因頻率差別無統(tǒng)計學意義。 3、CYP1A1基因多態(tài)性與

13、表達的關(guān)系RT-PCR和免疫組化結(jié)果基本一致：易感基因型m2m2和Val/Val個體CYP1A1表達率均為100％。而非易感基因型個體CYP1A1表達率為54-72％。組間統(tǒng)計學有顯著差異(p<0.05)，說明CYP1A1基因多態(tài)性可以明顯地影響酶的表達量及活性。 四.大連地區(qū)進展期胃癌的CIMP分布特征CIMP-H在胃癌、癌前以及癌旁相對正常組織中的發(fā)生率分別為51.1％(24/47)、23.8％(5/21)和0％(0/16)

14、；CIMP-L，分別為38.3％(18/47)、71.4％(15/21)和75％(12/16)；而CIMP-N則分別為10.6％(5/47)、4.8％(1/21)和25％(4/16)，在不同進展期胃癌組間差異顯著(p=0.001)。結(jié)果說明多位點甲基化與胃癌進展有關(guān)。隨著胃癌的演進，甲基化基因種類明顯增多，甲基化程度增強。非癌患者檢測結(jié)果全部31例正常對照中無CIMP-H型個體，但出現(xiàn)38.7％(12／31)的CIMP-L個體。除p16

15、外的其他4個位點的甲基化情況與胃癌組相比存在較大差異，具有統(tǒng)計學意義(19=0-0．008)。 五．CDH1啟動子甲基化檢測胃癌粘膜組織中CDH1基因啟動子甲基化率為48．9％(23／47)，與胃癌CIMP型、進展、年齡因素及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。 六．大連地區(qū)胃癌CIMP分布與CYP1A1基因表達的相關(guān)性分析CYPA1在CIMP-H組中的檢測陽性率為100％(20／20)，在CIMP-L／N組中的檢測陽性率為62．5

16、％(10／16)，組間差異顯著(p<0．01)。 結(jié)論： 一．CYP1A1基因表達是大連地區(qū)胃癌發(fā)病過程中的一個重要分子事件，出現(xiàn)于胃癌發(fā)生早期并貫穿始終，在不同進展期胃癌組織中CYP1A1表達水平不同。可以把它作為衡量環(huán)境化學致癌因子影響和判斷大連高發(fā)區(qū)胃癌病變程度的潛在分子標記物； 二．大連地區(qū)胃癌中CYP1A1基因的高表達是由外源環(huán)境化學因素誘導并由AhR介導途徑實現(xiàn)； 三．CYP1A1基因多態(tài)性與

17、大連地區(qū)胃癌易患性未見明顯相關(guān)性。但不同基因型個體CYP1A1表達及酶活性存在顯著差異。這說明，易感基因型個體易被誘導表達且酶活性增高，但由于本地區(qū)可能存在較強有力的環(huán)境暴露因子，因而導致易感基因型及非易感基因型個體的易患性高度都可超過閾值而發(fā)病； 四．胃癌不同病變組與正常對照組中CIMP型分布有顯著差異，說明大連高發(fā)區(qū)胃癌的發(fā)生可能依賴于一種異常甲基化途徑；異常甲基化在本地區(qū)胃癌發(fā)生過程中屬早期事件，并隨疾病的演進而增強;