PGC基因tagSNP與胃癌及萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及其分子機(jī)制研究.pdf

1、胃癌是由宿主和環(huán)境因素等共同作用所致的最常見惡性腫瘤之一，具有明顯的遺傳異質(zhì)性、表型復(fù)雜性、種族差異性等特征。它的發(fā)生發(fā)展可能涉及炎癥、癌前狀態(tài)和癌三個(gè)不同階段。尋找正常/淺表性胃炎—＞萎縮性胃炎—＞胃癌發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)的宿主基因變異，對(duì)于識(shí)別胃癌高風(fēng)險(xiǎn)個(gè)體，揭示胃癌遺傳易感性具有重要意義。
　　胃蛋白酶原C（Pepsinogen，PGC）蛋白是主要由胃主細(xì)胞分泌的關(guān)鍵性消化功能蛋白，是胃黏膜上皮細(xì)胞分化成熟標(biāo)志分子，是幽門螺桿菌

2、(Helicobacterpylori，HP)感染胃黏膜的效應(yīng)因子，是維持胃內(nèi)穩(wěn)態(tài)環(huán)境的重要組成成分。研究發(fā)現(xiàn)，在胃粘膜上皮細(xì)胞從正常-＞炎癥-＞癌前病變-＞癌的發(fā)展鏈條中，PGC蛋白原位表達(dá)水平隨著細(xì)胞惡性發(fā)展逐漸降低，在胃癌組織中表達(dá)缺失，提示PGC蛋白表達(dá)與胃癌不同發(fā)病階段密切相關(guān)。編碼PGC蛋白的PGC基因位于染色體6p21.3-21.1區(qū)，據(jù)HapMap數(shù)據(jù)庫(kù)顯示(www.hapmap.org)中國(guó)漢族北京人群PGC基因內(nèi)及其

3、上下游基因5000bp序列之間至少存在12個(gè)常見單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP），共有8個(gè)標(biāo)簽SNP(tagSNP)。前期我們利用Sequenom MassARRAY中通量基因分型平臺(tái)，初步發(fā)現(xiàn)PGC基因3個(gè)tagSNPs與胃癌及萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，包括rs9471643、rs6458238、rs4711690。關(guān)于這三個(gè)tagSNP與胃癌及萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)在同樣背景人群

4、中是否能重現(xiàn)，其余5個(gè)PGC tagSNP與胃癌及萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)是否亦存在關(guān)聯(lián)，多態(tài)分子功能如何，這些問(wèn)題有待進(jìn)一步探討。
　　本研究通過(guò)擴(kuò)大樣本并擴(kuò)大范圍進(jìn)行全部PGC tagSNP與胃癌及萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系研究，同時(shí)探討PGC tagSNP與HP感染以及HP感染相關(guān)宿主基因tagSNP在胃癌及萎縮性胃炎發(fā)病過(guò)程中的交互作用。在明確易感基因多態(tài)與疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系基礎(chǔ)上，進(jìn)一步闡明其分子功能及調(diào)控疾病發(fā)生的分子機(jī)制，從而為

5、揭示胃癌遺傳機(jī)制提供更多實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法：
　　1.利用Sequenom MassARRAY中通量技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行基因多態(tài)分型檢測(cè)。采用多因素Logistic回歸進(jìn)行多態(tài)與疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)性分析。
　　2.利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清HP-IgG含量。以HP-IgG抗體滴度≥34EIU為HP血清學(xué)陽(yáng)性。采用Bredslow-Day test分析各個(gè)PGC tagSNP與胃癌及萎縮性胃炎在HP感染不同亞組間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度是否存

6、在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用多因素Logistic回歸的全因子模型和似然比法進(jìn)行PGC tagSNP與HP感染間交互作用分析。
　　3.采用Logistic回歸全因子模型和似然比法進(jìn)行PGC tagSNP與HP感染相關(guān)基因PTPN11、TLR4、IL1B tagSNP間交互作用分析。
　　4.利用Realtime-PCR方法定量檢測(cè)胃癌組織及癌旁5cm之外非癌組織PGCmRNA表達(dá)水平，比較PGC tagSNP不同基因型間PGC mR

7、NA表達(dá)水平差異。
　　5.利用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)正常胃黏膜組織PGC蛋白含量，比較PGCtagSNP不同基因型間原位PGC蛋白表達(dá)水平差異。
　　6.利用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清PGC蛋白含量，比較PGC tagSNP不同基因型間血清PGC蛋白表達(dá)水平差異。
　　7.利用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)，比較PGCrs9471643和PGC rs6458238不同等位基因型探針與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力差異。
　　8.利用熒

8、光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)PGL3-basic-PGC rs9471643-rs6458238G-G、G-A、C-G、C-A不同單體型報(bào)告質(zhì)粒的熒光素酶活性，比較不同單體型啟動(dòng)子活性差異。
　　結(jié)果：
　　1.通過(guò)2897例樣本驗(yàn)證研究，我們證實(shí)PGC rs4711690、PGC rs6458238、PGC rs3789210、PGC rs6939861、PGCrs9471643、PGC rs6939861與胃癌及/或萎縮性胃炎發(fā)病

9、風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。與各SNP常見基因型相比，rs4711690 CG或CG/CC基因型、rs6458238 GA或GA/AA基因型、rs3789210 CG/GG基因型均與萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，而rs6939861AG、AA或AG/AA基因型與萎縮性胃炎及胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加均相關(guān)（所有P均＜0.05）。另外，與GG/CC基因型相比，rs9471643GC基因型個(gè)體胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)顯著降低(P=0.025)。本研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)rs6912200、rs

10、6941539單獨(dú)與胃癌或萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（所有P值＞0.05）。
　　2.采用Bredslow-Day test分析各個(gè)PGC tagSNP與胃癌及萎縮性胃炎在HP感染不同亞組間的關(guān)聯(lián)強(qiáng)度是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)rs4711690 CG、CG/GG型與萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)強(qiáng)度在HP感染與非感染組間存在顯著差異;rs6912200 CT、TT和CT/TT型與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)關(guān)聯(lián)強(qiáng)度在HP感染與非感染組間存在顯著差異。

11、>　　3.PGC tagSNP-HP交互作用分析發(fā)現(xiàn)rs4711690 CG/GG基因型與HP感染在萎縮性胃炎發(fā)病過(guò)程中存在顯著正交互作用(P=0.006，OR=1.79); rs6912200 CT/TT基因型與HP感染在胃癌發(fā)病過(guò)程存在正交互作用(P=0.030，OR=1.75)。
　　4.PGC tagSNP與HP感染相關(guān)基因SNP的二維交互作用分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):對(duì)于萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，PGC rs6912200 CT/TT基因

12、型與PTPN11 rs12229892 GA/AA基因型存在正交互作用(OR=1.97，95％CI:1.18，3.31; P=0.010)（表5）。對(duì)于胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，PGC rs6912200 CT/TT基因型與PTPN11 rs12229892 GA/AA基因型存在正交互作用(OR=1.96，95％CI:1.13，3.42; P=0.017)。另外，PGC rs4711690CG/GG基因型與IL1B rs1143623 GA/AA基

13、因型存在負(fù)交互作用(OR=0.65，95％CI:0.42，0.99; P=0.047)。三維交互分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):PGC rs4711690 CG/GG、PGC rs6912200 CT/TT、PTPN11 rs12229892 GA/AA在萎縮性胃炎發(fā)病中存在三維交互作用(OR=2.82，95％CI:1.01，7.85;P=0.048)，且彼此之間的正交互作用在在HP感染個(gè)體中明顯增強(qiáng)(OR=6.13，95％CI:1.20，31.24;

14、P=0.029)。
　　5.PGC tagSNP與HP感染以及HP感染相關(guān)基因SNP的四維交互作用分析發(fā)現(xiàn)PGC rs4711690-PGC rs6912200-PTPN11 rs12229892-HP感染四個(gè)因子間交互作用沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(OR=6.49，95％CI:0.73，57.33; P=0.093)。
　　6.在基因轉(zhuǎn)錄水平，我們發(fā)現(xiàn)在胃癌組中PGC rs9471643 GC基因型個(gè)體PGCmRNA表達(dá)水平顯著高

15、于GG基因型個(gè)體(P=0.032)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它tagSNP與PGC mRNA表達(dá)水平存在相關(guān)（所有P＜0.05）。
　　7.在原位蛋白水平，我們發(fā)現(xiàn)在基本正常胃粘膜組織胃體、胃角、胃竇三個(gè)部位PGC蛋白表達(dá)豐度逐漸下降，且存在顯著差異(P＜0.001)。在胃體部，rs9471643 GC型個(gè)體PGC蛋白表達(dá)水平明顯高于GG型或者CC/GG型個(gè)體(P=0.007和0.019)。rs6912200 CT、TT或CT/TT型個(gè)體PGC

16、蛋白表達(dá)水平顯著低于常見CC型個(gè)體（P分別為0.14、0.032、0.042）。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)其它多態(tài)與PGC蛋白原位表達(dá)水平相關(guān)（所有P＜0.05）。
　　8.在血清蛋白水平，我們?cè)趯?duì)照人群中發(fā)現(xiàn)，rs9471643 GC型PGC蛋白血清表達(dá)水平高于GG或GG/CC型者(P=0.004、0.006)，rs6458238GA和GA/AA型PGC蛋白血清表達(dá)水平高于GG型者(P=0.003、0.002)。在萎縮性胃炎中，rs6912200

17、 CT型PGC蛋白血清表達(dá)水平低于CC型者(P=0.039)。
　　9.在體外實(shí)驗(yàn)中，啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與常見G-G型相比，含PGC rs9471643-PGCrs6458238 C-G、G-A、C-A單體型報(bào)告基因啟動(dòng)子活性顯著升高（P均＜0.001）。
　　10.在體外實(shí)驗(yàn)中，EMSA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PGC rs9471643和PGC rs6458238多態(tài)不同等位基因探針與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力存在差異。在

18、N87、SGC-7901、MGC-803細(xì)胞中，rs9471643變異的C探針與細(xì)胞核提取物結(jié)合能力比G探針更強(qiáng)。在MKN45和GES1細(xì)胞中，rs6458238常見的G探針與細(xì)胞核提取物結(jié)合能力比A探針更強(qiáng)。序列競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提示這些序列-蛋白結(jié)合復(fù)合物可被40倍及80倍高濃度非標(biāo)記rs9471643 C探針和非標(biāo)記rs6458238 G探針顯著抑制，證實(shí)rs9471643 C探針、rs6458238 G探針和特定轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合具有序

19、列特異性。
　　結(jié)論：
　　1.單一多態(tài)研究結(jié)果提示，PGC基因rs4711690、rs6458238、rs3789210與萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，rs6939861與萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān);rs9471643與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)，rs6939861與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。PGC單一tagSNP具有胃癌及萎縮性胃炎風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)作用。
　　2.SNP-HP交互作用研究結(jié)果提示，PGC rs4711690-HP感染在

20、萎縮性胃炎發(fā)病中存在交互作用，PGC rs6912200-HP感染在胃癌發(fā)病中存在交互作用。PGCtagSNP可能是HP感染損傷宿主胃黏膜、促進(jìn)胃癌發(fā)生的重要應(yīng)答位點(diǎn)。
　　3.SNP-SNP交互作用研究結(jié)果提示，PGC rs4711690-IL1B rs1143623在胃癌發(fā)病中存在交互作用，PGC rs6912200-PTPN11 rs12229892在萎縮性胃炎及胃癌發(fā)病中均存在交互作用，而且PGC rs4711690-PG

21、C rs6912200-PTPN11 rs12229892在萎縮性胃炎發(fā)病中存在交互作用。PGC tagSNP聯(lián)合其它基因多態(tài)可以提高胃癌及萎縮性胃炎風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)能力。
　　4.PGC基因5'上游區(qū)rs9471643、rs6458238 tagSNP可以改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力、增強(qiáng)啟動(dòng)子活性、上調(diào)PGC基因不同水平的表達(dá)，進(jìn)一步明晰了rs9471643、rs6458238 tagSNP降低胃癌及萎縮性胃炎發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的可能機(jī)制。