HLA-B27分子參與脊柱關(guān)節(jié)病發(fā)病機制的初步探討.pdf

1、脊柱關(guān)節(jié)病(SpA)在我國的發(fā)病率和致殘率都較高，但其病因及發(fā)病機制均未完全明了，其中，HLA-B27在SpA的發(fā)病中起重要作用。目前有關(guān)其參與SpA發(fā)病主要有以下幾個假說：1) 分子模擬假說：HLA-B27 經(jīng)典的HLA-I類分子結(jié)構(gòu)通過將關(guān)節(jié)炎多肽提呈至CD8+T細胞的TCR上而誘導關(guān)節(jié)炎；2)HLA-B27異常形式的免疫識別：在多種因素影響下，細胞表面存在多種B27的異常形式，包括自由重鏈(FHC)，重鏈同源二聚體等，被特異的CD

2、4+ T 細胞、NK細胞等識別從而誘發(fā)炎癥損傷；3) 蛋白錯誤折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與炎癥反應：HLA-B27 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的折疊速率減慢，造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，引發(fā)未折疊蛋白反應(UPR)導致炎癥反應。目前理論上有關(guān)SpA的發(fā)病機理更傾向于后兩種假說。 在HLA-B27 轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)，表達自由重鏈的細胞可能在SpA 中發(fā)揮重要作用，但在人的細胞研究中相關(guān)研究較少而且結(jié)果不一致。而有關(guān)蛋白錯誤折疊，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激與炎癥反應參與SpA 發(fā)病的假

3、說，目前只在動物實驗中得到部分證實。另外，單核巨噬細胞在SpA 中發(fā)揮著重要作用，但相對于類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)，目前在這個領(lǐng)域研究較少。關(guān)于SpA 單核巨噬細胞分泌細胞因子的研究，目前大都集中在血清和滑液以及外周血或滑液單個核細胞(PBMC 或SFMC)，并不能真正反映單核細胞的功能狀態(tài)，而且結(jié)論不一。 所以本課題旨在：1. 研究自由重鏈(FHC)在SpA 患者細胞上的表達及其B27 分子與這些自由重鏈的關(guān)系；2. 檢測SpA

4、 患者細胞尤其是單核巨噬細胞中是否存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(UPR)，而且HLA-B27 分子在單核細胞系的過表達能否誘發(fā)UPR，初步判定HLA-B27 與UPR 反應參與SpA 的發(fā)病機理；3. 研究單核巨噬細胞分泌的細胞因子在SpA 中作用，并檢測HLA-B27, HLA-A2 轉(zhuǎn)染細胞在不同刺激條件下分泌的多種細胞因子，初步探討HLA-B27 和單核細胞分泌細胞因子參與SpA 的發(fā)病機理。 方法：分三大部分。 1

5、. 采用免疫熒光標記、流式細胞術(shù)測定了SpA患者外周血(PB)和滑液(SF)CD3+ 淋巴細胞和CD14+ 單核細胞上自由重鏈(FHC)的表達水平。同時用MHC-I單抗檢測，以FHC相對于MHC-I的比例來表示FHC相對表達水平。 另外，我們研究了FHC表達水平與HLA-B27 表達以及疾病活動度之間的相關(guān)關(guān)系。另外采用轉(zhuǎn)染HLA-B27-EGFP、HLA-A2-EGFP和EGFP的單核細胞系U937 細胞，檢測其表面FHC表

6、達水平。 2. 用流式細胞術(shù)檢測SpA患者PB和SF CD3+細胞和CD14+細胞內(nèi)GRP78 的表達，同時分離PB和SF單核細胞，用免疫熒光檢測GRP78 表達和用半定量RT-PCR反應來檢測UPR相關(guān)指標GRP78，CHOP，XBP-1 mRNA表達。另外，用免疫熒光和RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染HLA-B27-EGFP、HLA-A2- EGFP和只轉(zhuǎn)染EGFP的U937 細胞及其在不同刺激(PMA, LPS, IFN-γ, TN

7、F-α) 條件下GRP78 表達和GRP78，CHOP，XBP-1 mRNA的表達。 3．用免疫磁珠陰性分選法分離出SpA 患者中PB 和SF 的單核巨噬細胞，在體外短期培養(yǎng)，用流式CBA 法檢測分泌的多種細胞因子，并觀察其與疾病活動指標和HLA-B27 的相關(guān)關(guān)系。同時檢測轉(zhuǎn)染HLA-B27-EGFP、HLA-A2-EGFP 和只轉(zhuǎn)染EGFP 的U937 細胞及其在不同刺激條件（PMA,LPS, IFN-γ, TNF-α）下

8、分泌的多種細胞因子的不同。 結(jié)果： 1．SpA患者外周血CD14+細胞上FHC的表達的相對水平較正常對照和RA患者顯著增高，而CD3+淋巴細胞上三者的FHC相對表達水平無明顯差異。同時FHC在SpA患者滑液CD14+單核巨噬細胞上相對表達更高。SpA患者PB和SF細胞上FHC的表達與B27 和β2-M表達水平無明顯相關(guān)，但SpA患者SFCD14+ 細胞上FHC相對表達水平與患者ESR（相關(guān)系數(shù)r＝0.89），CRP （

9、相關(guān)系數(shù)r＝0.78）和BASDAI（r＝0.67）均有顯著相關(guān)性（P<0.05）。B27 表達陽性的U937細胞表面，未刺激和刺激后自由重鏈的表達都較多，與EGFP-U937和A2-U937相比有顯著差異（P<0.05）。 2．SpA患者外周血和滑液CD14+細胞內(nèi)GRP78 的的表達率較正常對照外周血顯著增高(P<0.05)，SF較PB也有顯著增加(P<0.05)。PCR結(jié)果顯示與正常對照和SpA患者PB相比，SpA患者S

10、F單核巨噬細胞中CHOP、GRP78 和XBP-1的表達都相對較強(P<0.05)。PCR結(jié)果也顯示未刺激和PMA、IFN-γ、LPS和TNF-α刺激轉(zhuǎn)染細胞后，CHOP、GRP78 和XBP-1 的表達在轉(zhuǎn)染的三種細胞間均無顯著差異。免疫熒光染色顯示未刺激和TNF刺激情況下，三種轉(zhuǎn)染細胞的GRP78 熒光表達強度無顯著差異，而且B27-U937 細胞中B27 的表達與GRP78 的表達并不一致。而IFN-γ刺激后， B27 轉(zhuǎn)染細胞的

11、GRP78 表達較A2 -U937 和EGFP-U937 細胞增高。 3．對于磁珠分離出的外周血單核細胞培養(yǎng)上清，正常對照的細胞因子水平相對都較低，而AS 和RA 患者PB 中TNF-α，IL-10，IL-6 和IL-1β的表達水平較正常對照顯著升高(P<0.05)。AS 和RA SF 分離出單核細胞培養(yǎng)上清中這些細胞因子的表達水平也較高。同時發(fā)現(xiàn)AS PB 分離細胞培養(yǎng)上清中IL-1β的表達與患者CRP 相關(guān)(r=0.425

12、 P＝0.037)，而IL-8 的表達與ESR相關(guān)(r=0.413 P＝0.042)，但這些細胞因子與患者HLA-B27 表達強度之間均無明顯相關(guān)。在轉(zhuǎn)染細胞中，未刺激以及PMA、TNF 和IFN 刺激后的B27-U937 細胞表達的細胞因子和A2-U937 和EGFP-U937之間無明顯差異。 但在細胞用LPS 刺激后，發(fā)現(xiàn)B27-U937 細胞分泌的IL-6，IL-1β和IL-10比另外兩種細胞顯著增高。 結(jié)論:

13、 1．MHC-I類分子自由重鏈在SpA患者單核細胞表面表達增多，B27轉(zhuǎn)染的U937細胞表面也發(fā)現(xiàn)高表達MHC-I自由重鏈，提示MHC-I類分子自由重鏈中HLA-B27分子可能占很大比例，從而參與SpA發(fā)病。 2．建立單核細胞分離、檢測和B27表達陽性單核細胞株UPR檢測等體系，首次證實SpA患者單核細胞中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)UPR反應，可能參與了SpA的發(fā)病。 同時發(fā)現(xiàn)靜息狀態(tài)下B27的過表達與UPR反應可能無直接關(guān)系，

14、而IFN-γ刺激可能會引起B(yǎng)27表達的細胞中UPR反應增加，其相關(guān)關(guān)系和機理還需進一步研究。此實驗體系為進一步研究提供了較好基礎(chǔ)，其初步結(jié)果也為明確UPR參與SpA的發(fā)病機制提供了重要線索。 3．發(fā)現(xiàn)AS患者單核細胞分泌的多種炎癥因子TNF-α，IL-10，IL-6和IL-1β升高，可能在AS中發(fā)揮著重要作用。同時，發(fā)現(xiàn)LPS刺激后B27轉(zhuǎn)染U937細胞也分泌更多的IL-6，IL-1β和IL-10，提示B27對于單核細胞在特定刺