Rab7b和LAPF負(fù)向調(diào)控TLRs信號通路的效應(yīng)與機(jī)制的研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分：晚期內(nèi)體/溶酶體定位的小G蛋白Rab7b抑臣噬細(xì)胞TLR9刺激產(chǎn)生的促炎性因子和Ⅱ型干擾素
　　 大量研究證明，TLR9的異常活化參與了多種自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等的發(fā)病過程?；谏鲜鲅芯渴聦崳琓LR9拮抗劑有望成為這些自身免疫性疾病防治的潛在靶點。為此，必須對于TLR9受體介導(dǎo)的效應(yīng)與相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制了解清楚，同時，發(fā)現(xiàn)并鑒定TLR9信號通路新的負(fù)向調(diào)控因子也具有十分重要的意

2、義。眾所周知，TLR9被活化后最終將被轉(zhuǎn)運到晚期內(nèi)體/溶酶體中，但是對于TLR9在細(xì)胞中的這一重新定位過程到底有何生物學(xué)重要意義，目前還不十分清楚。Rab7b是本實驗室從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中通過隨機(jī)大規(guī)模測序得到的一個與Rab7高度同源的新型分子，因此命名為Rab7b。Rab7b是一類鳥苷三磷酸酶，其主要定位在細(xì)胞的晚期內(nèi)體和溶酶體中。本實驗室之前的研究表明，Rab7b通過促進(jìn)TLR4的溶酶體途徑降解以負(fù)向調(diào)節(jié)TLR4信號通路，在

3、本研究中，我們發(fā)現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中TLR9的交聯(lián)可以通過ERK和p38途徑有效地抑制Rab7b的表達(dá)。相反，晚期內(nèi)體/溶酶體定位的Rab7b在細(xì)胞內(nèi)可以與TLR9共定位在溶酶體相關(guān)膜蛋白1(LAMP1)陽性的細(xì)胞器室內(nèi)，Rab7b對于MyD88以及其下游信號并不存在調(diào)控效應(yīng)，但是當(dāng)TLR9被活化后Rab7b通過直接促進(jìn)TLR9本身的溶酶體途徑降解的翻譯后修飾下調(diào)TLR9在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)。相應(yīng)的，Rab7b抑制TLR9下游的MAPK和NF-

4、κB等轉(zhuǎn)錄因子的活性進(jìn)而負(fù)向調(diào)節(jié)TLR9誘導(dǎo)的TNF-ɑ，IL-6等促炎性因子和IFN-β為代表的I型干擾素的產(chǎn)生。本研究結(jié)果提示，Rab7b通過促進(jìn)TLR9本身的降解從而抑制TLR9信號通路中多種信號分子和轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制由TLR9誘導(dǎo)的促炎性因子和I型干擾素的產(chǎn)生。該結(jié)果對于進(jìn)一步深入研究TLR9觸發(fā)的生物效應(yīng)與相關(guān)信號通路的調(diào)控機(jī)制提高了新的線索和實驗基礎(chǔ)。
　　 第二部分：凋亡誘導(dǎo)蛋白LAPF負(fù)向調(diào)控TLR3和TLR

5、9介導(dǎo)的促炎性因子和Ⅱ型干擾素產(chǎn)生的效應(yīng)與機(jī)制研究
　　 TLRs家族受體根據(jù)各自不同的亞細(xì)胞定位可以分成細(xì)胞膜表面的TLRs和細(xì)胞內(nèi)定位的TLRs兩大類。TLRs成員的不同空間分布可能存在一種與它們空間定位相關(guān)的調(diào)控新模式，為TLRs信號調(diào)控的機(jī)制研究提供了新的方向。本實驗之前我們從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中通過隨機(jī)大規(guī)模測序發(fā)現(xiàn)了的溶酶體相關(guān)的包含PH和FYVE結(jié)構(gòu)域的凋亡誘導(dǎo)蛋白LAPF并報道了其參與TNF-a誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)

6、胞凋亡過程。LAPF與細(xì)胞內(nèi)定位的TLRs成員相近的亞細(xì)胞定位使我們考慮是否存在LAPF參與胞內(nèi)定位TLRs信號調(diào)控的可能。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LAPF可以負(fù)向調(diào)控巨噬細(xì)胞中胞內(nèi)定位的TLR3和TLR9的信號通路，但卻不能調(diào)控細(xì)胞膜定位的TLR4信號通路。小鼠原代巨噬細(xì)胞中過表達(dá)LAPF可以抑制TLR3和TLR9介導(dǎo)的TNF-α，IL-6和IFN-β的產(chǎn)生，LAPF的這種負(fù)向調(diào)控效應(yīng)部分依賴于其包含的PH結(jié)構(gòu)域。不僅僅是細(xì)胞內(nèi)定位的TLRs，胞內(nèi)

7、dsRNA識別受體RIG-I同樣受到LAPF的調(diào)控。由RIG-I介導(dǎo)識別的仙臺病毒感染巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的IFN-β也同樣被LAPF所抑制。熒光差異雙向凝膠電泳以及后續(xù)的蛋白質(zhì)譜分析實驗發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)LAPF降低了細(xì)胞內(nèi)Calmodulin的總蛋白表達(dá)量。Calmodulin是細(xì)胞內(nèi)最重要的Ca2+結(jié)合蛋白，可以活化下游CamKII，而CaMKII在本實驗室之前的工作中已經(jīng)被證明是TLRs信號完全活化所必須的。此外，LAPF也可以通過其PH結(jié)

8、構(gòu)域與磷酸化的Akt相互結(jié)合從而促進(jìn)Akt的磷酸化。Akt的活化可以磷酸化下游底物GSK-3位于N-末端的抑制性絲氨酸磷酸化位點，從而抑制GSK-3的活性。GSK-3活性被抑制后竟?fàn)幮缘叵魅趿薔F-κB依賴的促炎性因子的產(chǎn)生。因此，與TLR3和TLR9有相同亞細(xì)胞定位的LAPF通過下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Calmodulin的表達(dá)量以及活化Akt/GSK-3信號通路從而負(fù)向調(diào)控TLR3/9介導(dǎo)的促炎性因子和I型干擾素的產(chǎn)生。該部分研究結(jié)果為細(xì)胞內(nèi)定位