稀土鑭化合物調(diào)控核因子κB信號通路的分子機制.pdf

1、研究背景:核因子-κB(NF-κB)是一種廣泛存在于哺乳動物多種細胞具有多向性調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)分子，是細胞中一個對環(huán)境改變發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子，它調(diào)節(jié)大量與細胞應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答和細胞抗凋亡等相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB活化的失調(diào)參與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程，例如感染性休克(膿毒癥)、多臟器功能衰竭等燒傷臨床上常見，目前尚缺乏特異的治療方法的并發(fā)癥，而NF-κB在這些并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中起著非常重要的作用；其他如缺血再灌注

2、損傷、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、支氣管哮喘、動脈粥樣硬化、潰瘍性結(jié)腸炎、老年性癡呆、腫瘤細胞抗凋亡及艾滋病(AIDS)等的發(fā)生和發(fā)展也都與NF-κB的過度活化直接相關(guān)。近年來，研究發(fā)現(xiàn)NF-κB信號系統(tǒng)受到許多金屬元素的影響。如金、鋅、銅等不同化合物均可通過抑制IKKs(IκB激酶)的活性來阻斷NF-KB的活化；金精三羧酸主要通過強烈抑制NF-κB與DNA結(jié)合來控制艾滋病毒HIV活性；許多金屬如金、鈀、鎳及汞亦可影響NF-κB與DNA結(jié)合從而調(diào)節(jié)靶

3、基因的激活。鑭是一種化學(xué)性質(zhì)十分活躍的稀土金屬，研究證實稀土具有抗菌、促進創(chuàng)面愈合、調(diào)節(jié)細胞免疫功能等作用。臨床上，稀土已經(jīng)在磁共振、時間分辨檢測、放射性同位素診斷中用作診斷試劑，鈰浴法還用于治療燒傷患者；2004年10月，碳酸鑭被美國FDA批準用于臨床治療磷酸水平高的血透患者。前期研究工作證明稀土化合物氯化鑭對LPS引起的體內(nèi)效應(yīng)有明顯的拮抗作用。實驗表明鑭可降低內(nèi)毒素血癥小鼠炎癥介質(zhì)水平，減輕內(nèi)毒素對機體主要臟器的損傷，對致死量內(nèi)毒

4、素攻擊小鼠具有明顯的保護作用。本課題擬通過分析氯化鑭對多種細胞內(nèi)NF-κB上游相關(guān)信號分子以及NF-κB系統(tǒng)內(nèi)部的信號分子表達及活化的影響，并觀察氯化鑭對LPS誘導(dǎo)NF-κB所調(diào)控的下游炎癥反應(yīng)介質(zhì)表達的影響，探索鑭抑制NF-κB活化的可能機制，為臨床感染性休克(膿毒癥)、多臟器功能衰竭等疾病的治療提供新思路，并為開發(fā)稀土的藥用價值提供實驗依據(jù)。 第Ⅰ部分氯化鑭對內(nèi)毒素誘導(dǎo)NF-κB上游信號分子的作用 目的:分析氯化鑭對

5、LPS誘導(dǎo)NF-κB上游信號分子的表達和活化的影響。 研究方法： 1.細胞培養(yǎng)及分組：RAW264.7巨噬細胞：以含5％胎牛血清的DMEM/F12液體培養(yǎng)基稀釋細胞密度為1×106個/ml，分別接種于去熱原培養(yǎng)瓶中及預(yù)先放置無菌去熱源蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，實驗隨機分組如下：①LPS組：以含1μg/ml LPS的無血清DMEM/F12體培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞。②氯化鑭＋LPS組：以含

6、氯化鑭2.5μmol/L經(jīng)預(yù)實驗證明該濃度可以有效抑制NF-κB的活化)的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞4h后，棄培養(yǎng)基并以無熱原生理鹽水漂洗細胞三遍，再加入含1μg/ml LPS的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。③空白對照組：培養(yǎng)基為不含血清的DMEM/F12，不加氯化鑭和LPS。④氯化鑭對照組：以含氯化鑭2.5μmol/L的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)RAW264.7細胞。按檢測指標要求分別于不同時間段收集培養(yǎng)上清、細胞及細胞爬片待檢。

7、 2.研究內(nèi)容及方法： (1)觀察氯化鑭對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞表面Toll樣受體4(TLR4)基因表達(轉(zhuǎn)錄和翻譯)的作用：利用流式細胞術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)分析TLR4基因表達情況； (2)氯化鑭對LPS活化NF-κB上游部分信號通路的影響： ①觀察氯化鑭對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細胞p38MAPK蛋白表達和磷酸化的作用：采用細胞免疫熒光染色分析p38MAPK/p-p38

8、MAPK在巨噬細胞細胞中的分布與表達；免疫印跡技術(shù)測定巨噬細胞內(nèi)p38MAPK蛋白表達和磷酸化水平的改變。 ②觀察氯化鑭對LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細胞中PKC蛋白表達和磷酸化的作用：采用細胞免疫熒光染色分析PKC在巨噬細胞的表達和磷酸化轉(zhuǎn)位情況；Western blot測定巨噬細胞內(nèi)PKC蛋白表達和磷酸化水平的改變。 結(jié)論：氯化鑭通過阻斷NF-κB上游PKC信號通路，從而可能部分抑制NF-κB信號通路的活化。

9、 第Ⅱ部分氯化鑭對NF-κB信號通路中關(guān)鍵分子活化作用的分析 目的:觀察不同激活機制下(激活物分別為LPS及TNFα，靶細胞分別為RAW264.7及Hela細胞及NF-κB組成性活化細胞株U266)，氯化鑭對各細胞中NF-κB信號通路關(guān)鍵分子的蛋白表達和磷酸化及NF-κB/p65亞基與靶基因結(jié)合能力的影響，探索氯化鑭抑制NF-κB活化的可能作用位點。 研究方法 1.細胞培養(yǎng)及分組 (1)RAW264.7

10、細胞：(同上)。 (2)Hela細胞：以1×106個/ml接種細胞于含10％胎牛血清的RMPI 1640液體培養(yǎng)基中，于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，隨機分組如下：①TNFα組：以含TNFα20ng/ml的無血清RMPI 1640液體培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細胞。②氯化鑭＋TNFα組：分別以含氯化鑭5，25，50和100μmol/L的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細胞4h后棄培養(yǎng)基并以無熱原生理鹽水漂洗細胞三遍，再加入含TNFα2

11、0ng/ml的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。③空白對照組：培養(yǎng)基為不含血清的RMPI 1640，不加氯化鑭和FNF α。④氯化鑭對照組：以含氯化鑭100μmol/L的RMPI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Hela細胞。各組細胞根據(jù)檢測方法的要求分別培養(yǎng)于24孔培養(yǎng)板(孔中預(yù)先放置無菌蓋玻片)或培養(yǎng)瓶中，于，30min后，收集培養(yǎng)上清、細胞及蓋玻片待檢。 (3)U266細胞：以1×106個/ml接種細胞于含15％胎牛血清的RMPI 1640液體培養(yǎng)基的培

12、養(yǎng)瓶中，于5％CO2、37℃恒溫培養(yǎng)，細胞懸浮生長，隔天半量換液，實驗分組如下：①空白對照組：培養(yǎng)基為不含血清的RMPI 1640,不給予任何干預(yù)和刺激。②氯化鑭對照組：分別以含氯化鑭2.5，5，25，50和100μmol/L的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)U266細胞。各組細胞根據(jù)檢測方法的要求分別培養(yǎng)于培養(yǎng)瓶中，30min后收集培養(yǎng)細胞待檢。 2.檢測指標 (1)Western blot技術(shù)測定IκB上游激酶IKK α，IKKB的

13、表達和磷酸化情況； (2)Western blot技術(shù)測定胞漿提取物中IκBα蛋白表達和磷酸化水平； (3)細胞免疫熒光染色技術(shù)分析NF-κB/p65蛋白在細胞中的表達和分布； (4)Western blot技術(shù)測定胞核提取物中NF-κB/p65蛋白表達水平； (5)Transcription Factor Assay kit試劑盒(酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA))測定胞核提取物中p65蛋白與DNA靶序列

14、結(jié)合能力。 研究結(jié)果提示：對于NF-κB組成性活化U266細胞，氯化鑭不影響IKKβ的磷酸化及IκB α的磷酸化和降解，并無法逆轉(zhuǎn)NF-κB轉(zhuǎn)位，但能夠在細胞外條件下阻斷NF-κB/p65與靶DNA的結(jié)合。 第Ⅲ部分氯化鑭對LPS誘導(dǎo)NF-κB調(diào)控的炎癥介質(zhì)表達的影響 目的:通過觀察氯化鑭對LPS誘導(dǎo)的炎性因子TNF α、NO及誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)表達水平及活性的作用，了解氯化鑭對LPS誘導(dǎo)NF-κB

15、下游靶基因表達的影響。 研究內(nèi)容和方法: (1)實驗分組：(同第Ⅰ部分)。 (2)逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)測定TNF α及iNOS基因表達水平。 (3)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA)測定細胞上清中TNF α含量。 (4)細胞免疫熒光染色技術(shù)分析iNOS蛋白在細胞中的表達和分布。 (5)Western blot技術(shù)測定細胞中iNOS蛋白表達水平。 (6)硝酸還原酶法檢測

16、培養(yǎng)上清NO含量。 結(jié)果和結(jié)論: (1)氯化鑭對LPS誘導(dǎo)的NF-κB下游炎癥介質(zhì)TNFα表達和釋放的抑制作用：2.5μmol/L氯化鑭不僅能夠下調(diào)靜息狀態(tài)下巨噬細胞TNFα基因的表達和多肽的釋放還能夠顯著抑制LPS上調(diào)TNF α基因表達和多肽釋放。 (2)氯化鑭對LPS誘導(dǎo)NF-κB下游基因iNOS表達的抑制作用：2.5μmol/L氯化鑭能明顯下調(diào)iNOSmRNA的表達水平，減少iNOS蛋白的生成，顯著降低產(chǎn)物