miR-669n-SENP6及Rab5-7對(duì)LPS-TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，普遍存在著Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)家族，其歸屬于模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors，PRRs)，遺傳性狀被種屬基因所調(diào)控，行使著識(shí)別病原體相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)的功能。相應(yīng)的PAMPs，例如細(xì)菌、病毒及真菌等對(duì)免疫細(xì)胞的刺激，可促使其表達(dá)此類

2、受體分子。與其它TLRs類似，TLR4憑借著特異性識(shí)別功能，使其能夠結(jié)合細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide/endotoxin，LPS)而活化。TLR4是介導(dǎo)針對(duì)病原體相關(guān)分子的免疫反應(yīng)的一個(gè)非常重要的分子，其活化能夠促進(jìn)固有免疫系統(tǒng)的抗原提呈細(xì)胞功能性成熟，并觸發(fā)促炎介質(zhì)的釋放。TLR4在細(xì)胞膜上識(shí)別并結(jié)合LPS后，沿MyD88(myeloiddifferentiation primary response gene88

3、)依賴以及TRAM-TRIF依賴兩條途徑，開始了各自獨(dú)立的炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞。此過程中接頭蛋白TIRAP和TRAM起著分別募集信號(hào)適體蛋白MyD88和TRIF的作用，并與之配對(duì)從細(xì)胞膜及早期內(nèi)體分別啟動(dòng)兩條分子信號(hào)通路，將炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞到胞內(nèi)，活化核轉(zhuǎn)錄因子，引起炎癥因子和Ⅰ型干擾素的釋放。由于該通路過度激活會(huì)引起嚴(yán)重的炎癥及膿毒癥，因此信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中還有多種負(fù)調(diào)節(jié)蛋白分子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)反饋性抑制作用。這些負(fù)調(diào)控分子與炎癥信號(hào)通路中的效應(yīng)

4、分子交互作用，構(gòu)成精密而又復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)體系，最終決定著炎癥細(xì)胞活化的程度。目前對(duì)LPS/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究仍在不斷進(jìn)行中，有些調(diào)節(jié)機(jī)制尚待明確，許多調(diào)控分子還有待發(fā)現(xiàn)。
　　NF-κB作為L(zhǎng)PS/TLR4炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的最重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與了兩條信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，對(duì)通路中炎癥介質(zhì)的轉(zhuǎn)錄合成到了起關(guān)鍵調(diào)控作用。正常狀態(tài)下，它與其抑制物IκB形成復(fù)合物處于無活性狀態(tài)。細(xì)胞感受到外界刺激信號(hào)后，會(huì)將胞外這些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞漿

5、，使IκB發(fā)生磷酸化降解，NF-κB得到活化而進(jìn)入細(xì)胞核，繼而相關(guān)基因啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄表達(dá)，釋放炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6及IFN-γ。因此，尋找針對(duì)NF-κB調(diào)控的新方式能夠使了解LPS/TLR4信號(hào)通路的相關(guān)作用機(jī)制的程度得到進(jìn)一步深化。泛素(ubiquitin，Ub)可與靶分子共價(jià)結(jié)合介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解，在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞、炎癥免疫等方面發(fā)揮著重要作用。關(guān)于小泛素相關(guān)修飾物特異性蛋白酶6(SUMO-specificprotease6，

6、SENP6)，據(jù)最近研究報(bào)道，也會(huì)產(chǎn)生類似泛素的功效，令NF-κB必需調(diào)節(jié)蛋白(NF-κB essential modifier，NEMO)去SUMO(small ubiquitin related modifier)化，使NF-κB活性受到抑制，進(jìn)而展現(xiàn)其負(fù)調(diào)控NF-κB相關(guān)信號(hào)通路的功能。由于SENP6是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的NF-κB的抑制分子，目前對(duì)其在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不明確。小分子RNA是一段長(zhǎng)度約20-24核苷酸的非編碼小分

7、子RNA，能夠在目標(biāo)分子的mRNAs上，鎖定其3'端非翻譯區(qū)(3'-untranslated region，3'-UTR)進(jìn)行結(jié)合，從而介導(dǎo)目標(biāo)mRNA的降解或是遏制目標(biāo)分子在翻譯水平的表達(dá)。多項(xiàng)研究表明，作為近年來的研究熱點(diǎn)之一的小分子RNA(MicroRNAs，miRNAs)是蛋白質(zhì)在翻譯后水平的重要調(diào)控元件，有著非常廣泛的作用范圍。目前的研究表明，有多種與感染、炎癥免疫相關(guān)的蛋白均受到miRNAs的調(diào)控。另外，miRNAs在調(diào)節(jié)T

8、LRs信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面也發(fā)揮著重要作用。而miRNAs是否能夠通過調(diào)節(jié)使SENP6高表達(dá)從而調(diào)控NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，這仍需要后續(xù)的研究來確認(rèn)。
　　除轉(zhuǎn)錄因子NF-κB外，其上游的受體分子TLR4也在MyD88/TRAM-TRIF兩條信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)中都起到了重要作用。活化的TLR4能夠分別啟動(dòng)并調(diào)控兩條通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，因此對(duì)兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而言，它均具有重要生物學(xué)意義。而且有研究表明，在LPS介導(dǎo)的細(xì)胞活化中，細(xì)胞活化程度的強(qiáng)弱及相應(yīng)

9、的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)很大程度上受質(zhì)膜上TLR4的數(shù)量及其在胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率的影響;抑制TLR4-LPS復(fù)合物的內(nèi)化會(huì)促進(jìn)MyD88信號(hào)通路的活化。因此，TLR4將TRAM-TRIF信號(hào)途徑跟MyD88信號(hào)途徑緊密聯(lián)系在了一起，TLR4在胞膜及細(xì)胞器的分布變化可能對(duì)兩條通路信號(hào)的產(chǎn)生發(fā)揮了平衡調(diào)控作用。在真核細(xì)胞中，細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)活動(dòng)由關(guān)鍵調(diào)控分子Rab蛋白(Ras related in brain)調(diào)節(jié)。Rab蛋白不僅對(duì)TLR4的轉(zhuǎn)運(yùn)過程起到了調(diào)控作用

10、，而且其轉(zhuǎn)運(yùn)效率對(duì)TLR4的分布可能產(chǎn)生了重要影響。簡(jiǎn)而言之，有很大可能，胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)ab介入了對(duì)LPS/TLR4活化單核、巨噬細(xì)胞效應(yīng)的調(diào)控過程，但是還有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來揭示在此過程中Rab蛋白具體是如何發(fā)揮作用的。
　　之前，本課題組發(fā)現(xiàn)，氯喹(Chloroquine，CQ)能夠使膿毒癥小鼠的生存率發(fā)生顯著提高;氯喹預(yù)處理人外周血單個(gè)核細(xì)胞(hPBMC)以及小鼠巨噬細(xì)胞(ANA-1)會(huì)對(duì)LPS的活化(TNF-α、IL-6等多

11、種細(xì)胞因子釋放)產(chǎn)生顯著的負(fù)調(diào)控效果。而CQ本身不能結(jié)合和直接拮抗LPS的活性，因此其對(duì)炎癥的抑制效應(yīng)只能作用于LPS/TLR4信號(hào)通路的效應(yīng)分子。研究顯示，作為一種得到廣泛應(yīng)用的抗炎藥物，氯喹能夠?qū)PS/TLR4介導(dǎo)的單核、巨噬細(xì)胞過度活化產(chǎn)生抑制效果，但是迄今仍未明確該作用的潛在分子機(jī)制。這些提示我們，由于轉(zhuǎn)錄因子NF-κB能夠控制炎癥細(xì)胞因子的釋放，CQ很可能對(duì)的細(xì)胞因子上游的重要轉(zhuǎn)錄因子NF-κB產(chǎn)生抑制作用，這使我們考慮是否

12、SENP6也可能與CQ對(duì)LPS/TLR4信號(hào)通路的抑制作用有關(guān)。另外，課題組在之前的實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，CQ可能對(duì)細(xì)胞膜表面的TLR4表達(dá)有影響。這提示TLR4可能受到CQ的藥效影響，導(dǎo)致其在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)效率發(fā)生變化。該過程很可能與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)分子Rab對(duì)TLR4分布的調(diào)節(jié)有關(guān)，從而促使TLR4在質(zhì)膜上的數(shù)量及細(xì)胞內(nèi)的分布發(fā)生變化，造成TLR4聚集至胞內(nèi)細(xì)胞器或內(nèi)體而不再參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而使LPS誘導(dǎo)的單核巨噬細(xì)胞活化受到抑制。鑒于CQ對(duì)LPS/T

13、LR4信號(hào)通路中多個(gè)效應(yīng)分子的調(diào)節(jié)作用，我們應(yīng)用此功能將其作為工具對(duì)LPS/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行深入研究。
　　本課題從CQ對(duì)LPS/TLR4的兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制功能研究切入，藉由對(duì)不同炎癥效應(yīng)分子作用的實(shí)驗(yàn)，從兩個(gè)方面闡述LPS/TLR4信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控作用可能的發(fā)生機(jī)制。一方面研究SENP6/miRNAs直接對(duì)炎癥信號(hào)通路中最重要的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB產(chǎn)生的調(diào)控作用及相應(yīng)機(jī)制;另一方面則探討胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵分子Rab通過調(diào)節(jié)

14、細(xì)胞中TLR4分布表達(dá)，而對(duì)TLR4介導(dǎo)的兩條下游信號(hào)通路活化的影響及其可能機(jī)制。綜上所述，本課題以CQ的炎癥抑制作用作為切入點(diǎn)，藉由對(duì)LPS/TLR4信號(hào)通路被抑制的效應(yīng)進(jìn)行生物學(xué)機(jī)制研究，為進(jìn)一步闡明LPS/TLR4介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化中一些關(guān)鍵環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)機(jī)制并發(fā)掘新的炎癥調(diào)控分子奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.氯喹抑制LPS/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能研究
　　1.1用濃度20μg/ml CQ對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RA

15、W264.7預(yù)處理1h后，加入LPS(100ng/ml)刺激24h，細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-β蛋白表達(dá)情況以ELISA法確定;
　　1.2Western blot(WB)檢測(cè)TLR4下游炎癥信號(hào)通路分子變化:NF-κB上游抑制物IκB-α、干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)及信號(hào)通路MAPKs中的JNK、ERK1/2、p38蛋白及其磷酸化水平;
　　1.3激光共聚焦定位檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的亞基p65及IRF3轉(zhuǎn)位

16、入核情況。
　　2.miR-669n調(diào)控SENP6在抑制LPS/TLR4信號(hào)通路中作用的機(jī)制研究
　　2.1檢測(cè)SENP6和CQ之間是否存在量效關(guān)系及其對(duì)LPS刺激的巨噬細(xì)胞活化的作用；
　　2.2生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并確定RAW264.7細(xì)胞中以SENP6為靶標(biāo)分子的miRNAs；
　　2.3確認(rèn)miR-669n通過SENP6調(diào)控LPS刺激的巨噬細(xì)胞活化；
　　3.Rab5/7調(diào)節(jié)TLR4分布在抑制LPS/TL

17、R4信號(hào)通路中作用的機(jī)制研究
　　3.1氯喹調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá)及分布的功能研究；
　　3.2Rab5/7調(diào)控LPS/TLR4信號(hào)通路的機(jī)制研究；
　　3.2.1表達(dá)改變的Rab5、7造成的LPS/TLR4信號(hào)通路變化；
　　3.2.2 NH4Cl預(yù)處理引起的LPS/TLR4活化巨噬細(xì)胞作用的變化；
　　結(jié)果：
　　1.氯喹抑制LPS/TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的功能研究
　　1.1ELISA結(jié)果顯示，

18、CQ能夠顯著下調(diào)炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-β的表達(dá)(P＜0.05);
　　1.2 Western blot結(jié)果表明，CQ能夠顯著下調(diào)TLR4下游多個(gè)炎癥信號(hào)通路分子的磷酸化水平(pIκB-α、p-IRF3、p-JNK、p-ERK1/2、p-p38)，顯著促進(jìn)表達(dá)IκB-α(P＜0.05);
　　1.3激光共聚焦結(jié)果顯示，CQ能夠明顯抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB亞基p65及IRF3的轉(zhuǎn)位入核。
　　2.miR

19、-669n調(diào)控SENP6在抑制LPS/TLR4信號(hào)通路中作用的機(jī)制研究
　　2.1檢測(cè)SENP6的表達(dá)是否與CQ相關(guān)及其對(duì)LPS介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化的影響；
　　2.2生物信息學(xué)預(yù)測(cè)并確定RAW264.7細(xì)胞中以SENP6為靶標(biāo)分子的miRNAs；
　　2.3確認(rèn)miR-669n通過SENP6調(diào)控LPS刺激的巨噬細(xì)胞活化；
　　3.Rab5/7調(diào)節(jié)TLR4分布在抑制LPS/TLR4信號(hào)通路中的作用機(jī)制研究
　

20、　3.1氯喹調(diào)節(jié)TLR4的表達(dá)及分布的功能研究；
　　3.2Rab5/7調(diào)控LPS/TLR4信號(hào)通路的機(jī)制研究；
　　3.2.1表達(dá)改變的Rab5、7造成的LPS/TLR4信號(hào)通路變化；
　　3.2.2NH4Cl處理細(xì)胞后，ELISA結(jié)果顯示，炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-β表達(dá)水平無顯著變化;Western blot結(jié)果顯示，Rab5、7分子的蛋白表達(dá)水平無顯著變化。
　　結(jié)論：
　　1.確定

21、CQ的預(yù)處理對(duì)LPS/TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴及TRIF/TRAM依賴的兩條信號(hào)途徑均起到了抑制作用。
　　2.SENP6蛋白能夠負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞活化;驗(yàn)證了miR-669n的靶標(biāo)分子是SENP6，而miR-669n的表達(dá)下調(diào)可以促進(jìn)SENP6蛋白水平增加;miR-669n對(duì)靶標(biāo)SENP6的負(fù)調(diào)控作用可能是通過兩者mRNA的結(jié)合而抑制其蛋白翻譯的功能。miR-669n表達(dá)抑制引起的SENP6蛋白高表達(dá)能夠顯著抑制巨噬細(xì)胞的活化，

22、并且對(duì)膿毒癥小鼠具有保護(hù)作用。
　　3.CQ預(yù)處理能夠促進(jìn)LPS-TLR4復(fù)合體的內(nèi)化，使TLR4在早期內(nèi)體及晚期內(nèi)體中聚集;Rab5、7的表達(dá)上調(diào)會(huì)使其細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率提高，可能進(jìn)而影響到TLR4的胞內(nèi)分布;Rab5、7兩者中任何一個(gè)發(fā)生表達(dá)抑制，均會(huì)造成CQ抑制LPS/TLR4介導(dǎo)的細(xì)胞活化的作用顯著減弱。因此，轉(zhuǎn)運(yùn)分子Rab5、7可能協(xié)同合作以調(diào)節(jié)TLR4在細(xì)胞中分布的方式，從而發(fā)揮其炎癥抑制效應(yīng);CQ的炎癥抑制效應(yīng)與其酸化抑