HMGB1-A box對(duì)SW480和THP-1細(xì)胞LPS-TLR4信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的:
　　觀察HMGB1-A box高表達(dá)對(duì)腸上皮細(xì)胞株SW480和單核細(xì)胞株THP-1中LPS/TLR4的影響,為以HMGB1-A box為靶點(diǎn)治療IBD提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　?、?LPS對(duì)SW480細(xì)胞HMGB1表達(dá)的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組如下:
　　①對(duì)照組:SW480+0ng/ml LPS;
　?、趯?shí)驗(yàn)組1:SW480+100ng/ml LPS;
　?、蹖?shí)驗(yàn)組2:SW480+

2、1000ng/ml LPS;
　?、軐?shí)驗(yàn)組3:SW480+10000ng/ml LPS;
　　培養(yǎng)SW480細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,給予不同濃度LPS分別作用12h、24h收集細(xì)胞檢測(cè)HMGB1的表達(dá)(重復(fù)3次)。
　　㈡構(gòu)建和鑒定HMGB1-A box高表達(dá)細(xì)胞株
　?、臜MGB1-A box重組真核質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　?、僭贕eneBank中查找人HMGB1-A box基因序列,由公司基因合成。
　?、?/p>

3、將合成的HMGB1-A box基因插入到pEGFP-N1載體,構(gòu)建重組質(zhì)粒。擴(kuò)增及提取重組質(zhì)粒,鑒定方法采用酶切和測(cè)序。
　?、艸MGB1-A box重組真核質(zhì)粒在SW480細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)
　　采用陽脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pEGFP-N1-HMGB1-A box轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞,分別觀察有無綠色熒光及熒光強(qiáng)度,并收集細(xì)胞檢測(cè)HMGB1-A box mRNA表達(dá)水平(重復(fù)3次)。
　　㈢HMGB1-A box高表達(dá)和EP對(duì)SW

4、480腸上皮細(xì)胞HMGB1、LPS/TLR4信號(hào)通路及促炎因子的影響
　　實(shí)驗(yàn)分組:
　?、賹?duì)照組:SW480細(xì)胞;
　　②EP組:SW480細(xì)胞+EP;
　?、劭召|(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SW480細(xì)胞;
　?、蹵 box質(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染HMGB1-A box質(zhì)粒的SW480細(xì)胞
　　上述各組再分為L(zhǎng)PS及無LPS處理。( EP為5mM,預(yù)處理1h,LPS為1000ng/ml,24h),24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上

5、清及細(xì)胞(重復(fù)3次)。
　?、鐴P及HMGB1-A box高表達(dá)SW480細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)THP-1細(xì)胞HMGB1、LPS/TLR4信號(hào)通路及促炎因子分泌的影響
　　用Transwell系統(tǒng)將SW480細(xì)胞和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分組:
　?、賹?duì)照組:SW480細(xì)胞+THP-1;
　　②EP組:SW480細(xì)胞+EP+THP-1;
　?、劭召|(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的SW480細(xì)胞+THP-1;

6、>　?、蹵 box質(zhì)粒組:轉(zhuǎn)染HMGB1-A box質(zhì)粒的SW480細(xì)胞+THP-1
　　上述各組再分為L(zhǎng)PS處理及無LPS處理。( EP為5mM,預(yù)處理1h,LPS為1000ng/ml,24h),24h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清及細(xì)胞(重復(fù)3次)。
　　㈤檢測(cè)方法:
　?、賹?shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)細(xì)胞HMGB1、TLR4、MyD88 mRNA表達(dá)。
　　②免疫印跡方法檢測(cè)細(xì)胞HMGB1、TLR4、MyD88、pNF-

7、κB p65蛋白表達(dá)。
　?、垭p抗夾心ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1含量。
　?、芄滔喽嘀仉p抗夾心ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。
　　結(jié)果:
　?、錖PS對(duì)SW480細(xì)胞內(nèi)HMGB1的影響:
　　①不同濃度的LPS處理SW480細(xì)胞12h,SW480細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)都有升高,其中LPS濃度為100ng/ml組與對(duì)照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0

8、.05);不同濃度LPS處理24h時(shí),SW480細(xì)胞HMGB1 mRNA表達(dá)都有升高,其中1000ng/ml組HMGB1 mRNA表達(dá)與對(duì)照組相比,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),而其它組間HMGB1 mRNA表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　?、贚PS處理SW480細(xì)胞不同時(shí)間,24h組HMGB1 mRNA表達(dá)均高于12h組,但只有1000ng/ml組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),故本實(shí)驗(yàn)選用LPS的處理時(shí)間為24h,作用濃度

9、為1000ng/ml。
　?、鏄?gòu)建和鑒定HMGB1-A box高表達(dá)SW480細(xì)胞
　　⑴HMGB1-A box重組真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定
　　成功構(gòu)建pEGFP-N1-HMGB1-A box重組表達(dá)質(zhì)粒,酶切后瓊脂糖凝膠電泳顯示兩條帶,其分子量大小與預(yù)期大小相同。測(cè)序分析顯示插入片段與PubMed基因文庫(GenBank Accession:NM_002128.4)中的HMGB1-A box基因序列相似性為100％

10、。
　?、艸MGB1-A box重組真核質(zhì)粒在SW480細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)
　　HMGB1-A box重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SW480細(xì)胞后,在熒光顯微鏡下出現(xiàn)綠色熒光。細(xì)胞內(nèi)HMGB1-A box mRNA表達(dá)高于未轉(zhuǎn)染組(P<0.01),提示轉(zhuǎn)染成功。
　　㈢EP和HMGB1-A box高表達(dá)對(duì)SW480細(xì)胞HMGB1、LPS/TLR4信號(hào)通路及促炎因子分泌的影響
　?、鸥鹘M細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá):
　　

11、HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組和A box轉(zhuǎn)染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　　⑵各組細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA及蛋白的表達(dá):
　　TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),在LPS處

12、理組EP組顯著低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組和A box轉(zhuǎn)染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　?、歉鹘M細(xì)胞內(nèi)MyD88蛋白的表達(dá):
　　MyD88 mRNA和蛋白的表達(dá)在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組和A box轉(zhuǎn)染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計(jì)差異(P>0.

13、05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　?、雀鹘M細(xì)胞內(nèi)pNF-κB p65蛋白的表達(dá):
　　pNF-κBp65蛋白的表達(dá)在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組和A box轉(zhuǎn)染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。

14、r>　　⑸各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量:
　?、貶MGB1的含量在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組和A box轉(zhuǎn)染組(P<0.05),后3組之間無統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.01)。
　?、贗L-1β、TNF-α和IL-6的含量在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>

15、0.05),在LPS處理組EP組顯著低于對(duì)照組、空質(zhì)粒組和A box轉(zhuǎn)染組(P<0.05,0.01),后3組之間無統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05);除EP組,各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　?、鐴P及HMGB1-A box高表達(dá)SW480細(xì)胞與THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)THP-1細(xì)胞HMGB1、LPS/TLR4信號(hào)通路及促炎因子分泌的影響
　?、鸥鹘M細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá):

16、>　　THP-1細(xì)胞與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后,THP-1細(xì)胞中HMGB1 mRNA和蛋白的表達(dá)在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);在LPS處理組HMGB1 mRNA表達(dá)在EP組顯著低于對(duì)照組和空質(zhì)粒組(P<0.05),A box轉(zhuǎn)染組顯著低于空質(zhì)粒組(P<0.05),HMGB1蛋白表達(dá)在EP組和A box轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組和空質(zhì)粒組(P<0.05);除EP組和A box轉(zhuǎn)染組,各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組

17、(P<0.05,0.01)。
　?、聘鹘M細(xì)胞內(nèi)TLR4 mRNA及蛋白的表達(dá):
　　THP-1細(xì)胞與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后,THP-1細(xì)胞中TLR4 mRNA和蛋白的表達(dá)在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);在LPS處理組TLR4 mRNA表達(dá)在EP組和A box轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組和和空質(zhì)粒組(P<0.05),TLR4蛋白表達(dá)在EP組顯著低于對(duì)照組和空質(zhì)粒組(P<0.01),A box轉(zhuǎn)染組顯著低于空質(zhì)粒組(P

18、<0.05);除EP組和A box轉(zhuǎn)染組各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.05,0.01)
　?、歉鹘M細(xì)胞內(nèi)MyD88 mRNA及蛋白的表達(dá):
　　THP-1細(xì)胞與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后,THP-1細(xì)胞中MyD88 mRNA和蛋白的表達(dá)在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);在LPS處理組MyD88 mRNA和蛋白表達(dá)在 EP組和 A box轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組和空質(zhì)粒組(P<0.05);除EP

19、組和A box轉(zhuǎn)染組各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.05,0.01)。
　?、雀鹘M細(xì)胞內(nèi)pNF-κB p65蛋白的表達(dá):
　　THP-1細(xì)胞與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后,THP-1細(xì)胞中pNF-κBp65蛋白表達(dá)在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);在LPS處理組pNF-κBp65蛋白表達(dá)在EP組和A box轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組(P<0.01);A box轉(zhuǎn)染組顯著低于空質(zhì)粒組(P<0.01),

20、除EP組和A box轉(zhuǎn)染組各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.05)。
　?、筛鹘M細(xì)胞培養(yǎng)上清中HMGB1、IL-1β、TNF-α和IL-6的含量:
　　①THP-1細(xì)胞與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后,培養(yǎng)上清中HMGB1含量在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);在LPS處理組HMGB1含量在EP組和A box轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組和空質(zhì)粒組(P<<0.05,0.01);除EP組和A box轉(zhuǎn)染組各LP

21、S處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P<0.01)。
　?、赥HP-1細(xì)胞與SW480細(xì)胞共培養(yǎng)后,培養(yǎng)上清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量在無LPS處理組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);在LPS處理組它們的含量在EP組和A box轉(zhuǎn)染組顯著低于對(duì)照組和和空質(zhì)粒組(P<0.01);除EP組和A box轉(zhuǎn)染組各LPS處理均顯著高于相對(duì)應(yīng)的無LPS處理組(P>0.05,P<0.01)。
　　結(jié)論:
　　1、L