雙向調(diào)控PDIA3對SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、背景與目的：
　　短腸綜合征（short bowel syndrome，SBS）是指由多種病因?qū)е滦∧c廣泛切除，營養(yǎng)物質(zhì)吸收功能障礙的臨床綜合征。殘留小腸小于30cm稱為超短腸綜合征（ultra-short bowel syndrome，USBS）。SBS發(fā)病率近20年有明顯增高的趨勢。SBS會(huì)嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，嚴(yán)重者(USBS）需終身依賴腸外營養(yǎng)（parenteral nutrition，PN），而長期PN會(huì)導(dǎo)致肝功能損害

2、，感染和代謝并發(fā)癥，腸道黏膜萎縮，細(xì)菌移位等威脅患者生命，同時(shí)給家庭和社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究都已證實(shí)USBS存在結(jié)腸代償?shù)默F(xiàn)象。如何促進(jìn)USBS殘留結(jié)腸的代償，促進(jìn)結(jié)腸吸收功能，是USBS患者擺脫P(yáng)N，改善治療效果的一個(gè)值得探索的方向。對USBS結(jié)腸代償發(fā)生的蛋白質(zhì)分子機(jī)制進(jìn)行研究，尋找USBS結(jié)腸代償?shù)年P(guān)鍵蛋白，也許是研究的切入點(diǎn)。我們前期研究通過建立USBS大鼠模型，對USBS大鼠結(jié)腸黏膜組織進(jìn)行蛋白

3、質(zhì)組學(xué)研究，共得到蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶A3（Protein disulfide-isomerase isoform A3，PDIA3）等10余種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，PDIA3是一種廣泛分布在細(xì)胞中，發(fā)揮分子伴侶、損傷修復(fù)、細(xì)胞分泌、免疫調(diào)節(jié)等多項(xiàng)重要生理功能的重要蛋白質(zhì)，因此，我們推測PDIA3可能是USBS結(jié)腸代償?shù)闹匾盘柕鞍字弧?br>　　本研究的目的是通過對PDIA3的表達(dá)進(jìn)行雙向調(diào)控，觀察PDIA3對SW480細(xì)胞增殖和凋亡的影

4、響，驗(yàn)證PDIA3對結(jié)腸黏膜細(xì)胞促進(jìn)增殖的作用，為進(jìn)一步研究PDIA3在USBS結(jié)腸代償?shù)淖饔锰峁?shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.構(gòu)建pcDNA3.1/hisB-hPDIA3真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，運(yùn)用Western blotting測定SW480細(xì)胞中PDIA3表達(dá)的情況。運(yùn)用MTT法檢測過表達(dá)PDIA3對SW480細(xì)胞增殖的影響，按轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/hisB-hPDIA3質(zhì)粒劑量不同分為4組，比較轉(zhuǎn)染不同

5、劑量質(zhì)粒SW480細(xì)胞的增值率。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)PDIA3對SW480細(xì)胞凋亡的影響，分組同MTT實(shí)驗(yàn)，比較轉(zhuǎn)染不同劑量質(zhì)粒SW480細(xì)胞的凋亡率。
　　2.構(gòu)建hPDIA3-siRNA真核質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染至SW480細(xì)胞，運(yùn)用Western blotting測定SW480細(xì)胞中PDIA3表達(dá)的情況。運(yùn)用MTT法檢測過表達(dá)PDIA3對SW480細(xì)胞增殖的影響，按轉(zhuǎn)染hPDIA3-siRNA質(zhì)粒劑量不同分為7組，比較轉(zhuǎn)染不同劑量質(zhì)

6、粒SW480細(xì)胞的增值率。運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測過表達(dá)PDIA3對SW480細(xì)胞凋亡的影響，分組同MTT實(shí)驗(yàn)，比較轉(zhuǎn)染不同劑量質(zhì)粒SW480細(xì)胞的凋亡率。
　　結(jié)果：
　　1.DNA測序證實(shí)正確、成功地構(gòu)建了pcDNA3.1/hisB-hPDIA3真核表達(dá)質(zhì)粒和hPDIA3-siRNA真核質(zhì)粒。
　　2.Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/hisB-hPDIA3質(zhì)粒劑量越高，PDIA的表達(dá)量

7、就越高；轉(zhuǎn)染hPDIA3-siRNA質(zhì)粒的劑量越高，PDIA3的表達(dá)量反而越低。
　　3.在過表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，MTT結(jié)果顯示，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的吸光值均高于對照組（P<0.05），而且吸光值與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1/hisB-hPDIA3質(zhì)粒劑量呈正相關(guān)，說明PDIA3表達(dá)量越高，SW480細(xì)胞增殖率越高。流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示，三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率均低于對照組（P<0.05），而且細(xì)胞凋亡率與轉(zhuǎn)染劑量呈負(fù)相關(guān)，說明PDIA3的表達(dá)量越高，S

8、W480細(xì)胞凋亡率越低
　　4.在沉默實(shí)驗(yàn)中，5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞增值率與對照組不同（P<0.05），而且轉(zhuǎn)染hPDIA3-siRNA質(zhì)粒劑量最高，SW480細(xì)胞增值率最低；5個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率要顯著高于對照組（P<0.05），而且細(xì)胞凋亡率與轉(zhuǎn)染劑量呈正相關(guān)，說明PDIA3表達(dá)量越低，SW480細(xì)胞凋亡率越高。
　　結(jié)論：
　　1.成功構(gòu)建了pcDNA3.1/hisB-hPDIA3真核表達(dá)質(zhì)粒和hPDIA3-siRNA