HIV-1感染者pDC功能及TLR7-9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究.pdf

1、目的：
　　 類漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cell，pDC)是樹突狀細(xì)胞的一個重要亞群，因其在病毒刺激下能夠產(chǎn)生大量的IFN-α，發(fā)揮直接的抗病毒活性，又被稱為天然的干擾素α產(chǎn)生細(xì)胞(natural interferon producing cell，NIPC)。一方面pDC可以激活NK、NKT等天然免疫細(xì)胞，啟動固有免疫應(yīng)答;另一方面，pDC提呈抗原給T細(xì)胞，刺激T細(xì)胞活化，激活適應(yīng)性免

2、疫應(yīng)答;pDC在連接固有免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的作用。pDC表達(dá)Toll樣受體(toll-likereceptor，TLR)7和9，并且通過TLR7和TLR9對病毒核酸進(jìn)行識別，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而引起pDC表型及功能的改變，發(fā)揮其免疫活性。pDC中的TLR7/9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化將直接影響pDC的功能。
　　 HIV感染后，pDC數(shù)量下降，并且與疾病進(jìn)展有關(guān)，這說明pDC在抗HIV感染免疫中發(fā)揮著重要的作用

3、。HIV感染后，pDC功能也受到影響，包括活化成熟狀態(tài)以及細(xì)胞因子分泌功能的改變。pDC中的TLR7可以識別病毒的ssRNA，HIV慢性免疫活化引起細(xì)菌轉(zhuǎn)位增加，增多的CpG DNA可以被pDC中的TLR9識別。因此，TLR7/9信號通路可能在HIV-1感染后pDC的功能變化中發(fā)揮重要作用。HIV感染后pDC中TLR7/9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是如何變化的，它是如何影響pDC功能的，目前還不太清楚。本文以HIV-1慢性感染者為實(shí)驗(yàn)對象，研究HIV

4、-1慢性感染者pDC活化成熟狀態(tài)以及細(xì)胞因子分泌功能的改變，并且對pDC中TLR7/9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究，探討HIV-1慢性感染者pDC功能改變與TLR7/9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系，有助于我們深入了解HIV-1慢性感染者pDC功能改變的具體機(jī)制，為重建pDC功能提供靶點(diǎn)。
　　 方法：
　　 1、研究對象
　　 HIV-1慢性感染者(chronic HIV-1 infection，CHI)18例，均來

5、自中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院紅絲帶門診，平均年齡29.5(23-47)歲。入選標(biāo)準(zhǔn):中國男男性接觸感染者，感染時間均在兩年以上。其中15例未接受抗病毒治療，3例已經(jīng)接受抗病毒治療。
　　 健康對照組(normal control，NC)10例，平均年齡25(23-40)歲，入選標(biāo)準(zhǔn):血常規(guī)及肝功正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性，無免疫系統(tǒng)疾病。
　　 2、pDC分泌細(xì)胞因子IFN-α、TNF-α、IL-6、IL-

6、12功能的測定
　　 取一塊24孔板，將將復(fù)蘇好的約9×106 PBMC分別放入三個孔中，其中一孔加終濃度為1μg/ml的R848，另一孔加終濃度為5μM的ODN2216，剩余一孔為未刺激孔。三孔中均加入相應(yīng)的Golgi Plug，充分混勻后，將24孔板放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，孵育6小時。孵育結(jié)束后取9支流式管，每孔中的液體平均分至三管中，離心，首先進(jìn)行表面染色，加入相應(yīng)的熒光抗體組合（lin1/HLA-DR/CD1

7、23），混勻，4℃冰箱避光孵育30分鐘。表面染色后，加入Cytofix/Cytoperm solution4℃冰箱中破膜20分鐘。破膜結(jié)束后，洗滌，各管加入胞內(nèi)染料組合后充分混勻，4℃冰箱避光孵育30分鐘。洗滌，多聚甲醛固定后應(yīng)用LSRⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。
　　 3.pDC表面標(biāo)志CD40、CD80、CD83、CD86、CCR7的檢測
　　 復(fù)蘇約4×106 PBMC（外周血單個

8、核細(xì)胞），并平均分配至4個流式細(xì)胞管中。做好標(biāo)記，并分別加入相應(yīng)的熒光抗體組合，混勻，4℃冰箱避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每管加入2ml PBS重懸，離心，棄上清?；靹蚝蠹尤牒?％多聚甲醛的固定液200μl重懸，應(yīng)用BD LSRⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。
　　 4、pDC中TLR7/9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的檢測
　　 復(fù)蘇約5×106 PBMC，并平均分配至5個流式細(xì)胞管中。做好標(biāo)記

9、，首先進(jìn)行表面染色，加入相應(yīng)的熒光抗體組合（lin1/HLA-DR/CD123），混勻，4℃冰箱避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每管加入2mlPBS重懸，離心，棄上清。表面染色后，每管加入250ul Cytofix/Cytoperm solution4℃冰箱中破膜20分鐘。破膜結(jié)束后，洗滌，各管加入胞內(nèi)染料組合后充分混勻，4℃冰箱避光孵育30分鐘。洗滌，多聚甲醛固定后應(yīng)用LSRⅡ流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，BD FACSDivaTM軟件分析結(jié)果。

10、
　　 5、CD4+T細(xì)胞絕對值的檢測
　　 將20μl BD公司CD4 FITC/CD8 PE/CD3 PerCP試劑加入絕對計數(shù)管中，逆向加入50μl混勻的抗凝全血，室溫避光染色15分鐘，加入1×免洗溶血素450μl，室溫避光溶血15分鐘，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及MultiSET軟件檢測并分析得到CD4+T淋巴細(xì)胞的絕對值。
　　 6、HIV病毒載量測定
　　 取1ml EDTA抗凝血

11、漿，采用Roche公司COBAS(R) AmpliPrep(R)/COBAS(R)TaqMan(R) System自動載量儀上以實(shí)時熒光定量PCR方法測定病毒載量。全部操作按照操作說明書進(jìn)行。
　　 7、統(tǒng)計學(xué)分析
　　 應(yīng)用SPSS17.0和Graphpad5.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析和圖形制作，所有數(shù)據(jù)以中位數(shù)表示，兩組間實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，P＜0

12、.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、HIV-1慢性感染者pDC功能的改變:
　　 1、TLR7激動劑R848刺激作用下pDC產(chǎn)生IFN-α及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-12的變化情況:
　　 TLR7激動劑R848刺激后，HIV-1慢性感染者pDC中IFN-α的產(chǎn)生(2.05;1.075-4.60)顯著低于健康對照(5.7;2.175-9.55)(P=0.0327)。
　　

13、 TLR7激動劑R848刺激后，HIV-1慢性感染者pDC中炎性細(xì)胞因子TFN-a的產(chǎn)生(50.2;35.525-74.9)顯著低于健康對照(86.7;79.3-87，825)(P=0.0032);HIV-1慢性感染者IL-6和IL-12的產(chǎn)生與健康對照相比無明顯差異(P=0.4012;P=0.9425)。
　　 2、TLR9的激動劑ODN2216的刺激作用下pDC產(chǎn)生IFN-α及炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-12的變

14、化情況:
　　 TLR9激動劑OND2216刺激后，HIV-1慢性感染者pDC中IFN-α的產(chǎn)生(1.45;0-2.9)并未減少，與健康對照(0.8;0-2.37)相比無明顯差異(P=0.6105)。
　　 TLR9激動劑OND2216刺激后，HIV-1慢性感染者pDC中IL-12的產(chǎn)生(1.4;0-3.925)低于健康對照(3.3;2.05-9.525)，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.0787)。HIV-1慢性感染者TN

15、F-α和IL-6的產(chǎn)生與健康對照相比無明顯差異(P=0.5175;P=0.1249)。
　　 二、HIV-1慢性感染者pDC表面活化成熟標(biāo)志表達(dá)的變化:
　　 流式檢測HIV-1慢性感染者pDC表面活化成熟標(biāo)志CD40、CD80、CD83、CD86、CCR7的表達(dá)與健康對照相比均無顯著性差異(P=0.77; P=0.75; P=0.17;P=0.58; P=0.42)。
　　 HIV-1慢性感染者pDC表面CD4

16、0的表達(dá)與TLR7或者TLR9激動劑刺激后IFN-α的產(chǎn)生無顯著相關(guān)性(P=0.08; P=0.48)。
　　 三、HIV-1慢性感染者pDC中TLR7/9信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化:
　　 1、HIV-1慢性感染者pDC中TLR7與TLR9的表達(dá)變化:
　　 HIV-1慢性感染者pDC中TLR7的表達(dá)(96.6;84.22-97.92)顯著高于健康對照(87;57.85-94.4)(P=0.0396)。
　　

17、HIV-1慢性感染者pDC中TLR9的表達(dá)(93.3;80.4-96.95)也顯著高于健康對照(66.05;50.05-85.85)(P=0.0370)。
　　 2、HIV-1慢性感染者pDC中IRF7與NF-kB的表達(dá)變化:
　　 HIV-1慢性感染者pDC中IRF7的表達(dá)(36.1;13.3-56.42)顯著低于健康對照(52.85;36.72-74.95)(P=0.0466)。 HIV-1慢性感染者pDC中NF-k