RNA干擾雞TVB受體對ALV-B感染的影響.pdf

1、禽白血病的防治措施主要從控制傳染源、切斷傳播途徑、治療感染雞群三個環(huán)節(jié)進行，限于我國養(yǎng)禽業(yè)的基本情況，其中傳染源的控制和感染雞群的治療很難起到顯著的效果，而切斷傳播途徑是一條非常具有潛力且行之有效的思路。目前為止鮮有RNA干擾應用于病毒細胞受體的文獻報道，本研究在查閱相關(guān)文獻資料后，尚無發(fā)現(xiàn)雞TVB受體在細胞活動中的良性功能，于是設計了特異性抑制TVB受體蛋白合成的siRNA，從而防止ALV-B感染的研究。
　　B亞群禽白血病病毒

2、（ALV-B）的囊膜蛋白Env與TVB受體結(jié)合引起細胞死亡信號通路激活，從而誘導細胞凋亡。本研究利用這一特點，采用RNA干擾技術(shù)（RNA interface，RNAi），特異地沉默轉(zhuǎn)錄TVB受體的mRNA，使細胞不再表達能夠介導ALV-B感染的TVB受體，阻斷病毒入侵宿主細胞的途徑，從而達到抗病毒傳染的目的。本研究針對在雞體內(nèi)能夠介導ALV-B感染細胞的TVBS1和TVBS3兩型受體，分別以編碼這兩種受體的mRNA為靶向基因設計合成了2

3、對短的雙鏈小RNA（siRNA），根據(jù)載體特點和RNA干擾特點將siRNA中加入酶切位點和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，將其加工為 shRNA，然后連接到干擾載體pSilencer2.1-U6上，分別命名為TpS1-1、TpS1-2、TpS3-1、TpS3-2，并隨機合成一個陰性對照TpSC。按實驗計劃設置不同的分組，轉(zhuǎn)染入生長狀態(tài)良好的DF-1細胞中，篩選10天后獲得能夠穩(wěn)定復制轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的細胞系，用ALV-B對其攻毒，維持7天后運用間接免疫熒光法（IFA

4、）觀察 ALV-B在細胞中的復制情況。本研究的動物體內(nèi)實驗設計了3個接種陽性質(zhì)粒的實驗組和1質(zhì)粒陰性個對照組，雛雞一日齡時3個實驗組和質(zhì)粒陰性對照組按實驗計劃接種質(zhì)粒，四日齡時再次接種鞏固；7日齡時全部按計劃接種ALV-B。七日齡接種后，每6天剖檢一次，共進行5次，通過對體重、免疫器官重量、p27抗原及淋巴細胞CD4+、CD8+的連續(xù)檢測與分析以探究動物體內(nèi)RNA干擾ALV-B的復制作用。
　　細胞實驗結(jié)果可見實驗組1中代表ALV

5、-B的熒光數(shù)量相較于對照組有所減少，而實驗組2和實驗組3與對照組無明顯差別，初步驗證TpS1-1和TpS3-1的質(zhì)粒組合抑制了TVB受體的合成，TpS1-1+TpS3-2組合、TpS1-1對于TVB受體合成的抑制效果不明顯。動物實驗結(jié)果表明實驗組1的雞群對于ALV-B有一定的抵抗力，從而間接證明TpS1-1和TpS3-1質(zhì)粒的共同作用對于TVB受體干擾效果良好，而實驗組2和實驗組3與對照組無明顯差異，說明TpS1-1和TpS3-2質(zhì)粒共