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文檔簡介
1、目的:Ca2+在細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用,TRPV6是高度的Ca2+選擇性通道,是Ca2+向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的限速步驟。但是,TRPV6在雞體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚,本文旨在研究沉默TRPV6對鈣轉(zhuǎn)運(yùn)基因的影響,進(jìn)而闡明TRPV6在雞體內(nèi)的調(diào)節(jié)機(jī)制。
方法:根據(jù)已知Genebank TRPV6 mRNA序列和siRNA的設(shè)計原則,利用美國Ambion公司的在線設(shè)計軟件,進(jìn)行全基因掃描和分析。篩選3個可能的RNA干擾靶位點(diǎn),設(shè)計3個
2、siRNA序列(與雞的其他基因無同源性)和一個陰性對照序列(該序列與任何雞類基因均無同源性)。按照選定的干擾靶位點(diǎn)設(shè)計相應(yīng)的shRNA DNA表達(dá)模板,將shRNA與pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體連接,通過轉(zhuǎn)化、篩選、鑒定,選擇陽性克隆。為探明設(shè)計的3個TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒對成骨細(xì)胞TRPV6基因表達(dá)的抑制效果,提取高純度無內(nèi)毒素TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒,并將其轉(zhuǎn)染到雞成骨細(xì)胞,同時采用Real-time PCR
3、和Western-blot的方法檢測TRPV6定量表達(dá)變化,篩選出能有效抑制TRPV6表達(dá)的質(zhì)粒。并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到雞成骨細(xì)胞,同樣地采用Real-time PCR和Western-blot的方法檢測鈣轉(zhuǎn)運(yùn)基因、OPG和RANKL的定量表達(dá)變化。
結(jié)果:酶切和測序結(jié)果顯示,成功構(gòu)建了雞TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒。在探明TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒對成骨細(xì)胞TRPV6基因表達(dá)的抑制效果的試驗(yàn)中,Real-timePCR結(jié)果表明,與對
4、照組比較,在轉(zhuǎn)染48h后質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3可使TRPV6的表達(dá)水平降低45.7%(P<0.01),質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-2可使TRPV6的表達(dá)水平降低27.8%(P<0.05),而pSIREN-TRPV6-1并未明顯改變TRPV6的表達(dá)(P>0.05);Western-blot結(jié)果顯示,pSIREN-TRPV6-3可明顯抑制TRPV6的表達(dá)水平(P<0.01)。將重組質(zhì)粒pSIREN-TRPV6-3轉(zhuǎn)染到雞成骨細(xì)胞
5、,Real-time PCR結(jié)果顯示,calbindin-D28K的表達(dá)水平降低了27.9%(P<0.01),而PMCA1b、NCX1、OPG和RANKL的表達(dá)未發(fā)生改變。Western-blot結(jié)果表明:calbindin-D28K的表達(dá)顯著降低(P<0.01),RANKL的表達(dá)未明顯改變。
結(jié)論:成功構(gòu)建了雞TRPV6 RNA干擾質(zhì)粒;在成骨細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)過程中,TRPV6只調(diào)節(jié)calbindin-D28K的表達(dá),而對NCX1
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