力學(xué)拉伸應(yīng)變對成骨細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 骨是由細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)和無機(jī)物組成的特殊結(jié)締組織，是人體承擔(dān)力學(xué)載荷的主要器官，并通過骨組織細(xì)胞進(jìn)行骨塑建和重建。骨重建不僅受到遺傳、激素、新陳代謝、年齡等生物學(xué)因素的影響，而且還依賴于其所處的力學(xué)環(huán)境。由Wolff定律可知，力學(xué)載荷缺失導(dǎo)致骨量減少，而適度的力學(xué)刺激能夠促進(jìn)骨形成。成骨細(xì)胞來源于間充質(zhì)干細(xì)胞，是骨生長、重建和修復(fù)的關(guān)鍵細(xì)胞。成骨細(xì)胞以及它的前體細(xì)胞對周圍生物力學(xué)環(huán)境的變化非常敏感，可以將

2、感受到的力學(xué)信號轉(zhuǎn)變?yōu)樯飳W(xué)信號進(jìn)而調(diào)節(jié)骨內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。體內(nèi)骨組織所處的力學(xué)環(huán)境非常復(fù)雜，附著于骨基質(zhì)上的成骨細(xì)胞會受到多種生物學(xué)因素的干擾，因此，體內(nèi)實驗很難準(zhǔn)確反映力學(xué)刺激對成骨細(xì)胞的影響。對體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞進(jìn)行離體力學(xué)加載實驗可以有效排除體內(nèi)實驗中各種因素的干擾。此外，還可以設(shè)計力的加載方式、大小、頻率以及作用時間等力學(xué)參數(shù)準(zhǔn)確檢測力學(xué)刺激對成骨細(xì)胞的影響。成骨細(xì)胞是骨對力學(xué)信號進(jìn)行響應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，但力學(xué)刺激對成骨細(xì)胞的影響以及成

3、骨細(xì)胞的力學(xué)信號響應(yīng)機(jī)制仍不明確。本研究擬通過四點彎曲力學(xué)加載裝置對培養(yǎng)的成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度和不同時間的力學(xué)拉伸，研究力學(xué)信號對成骨細(xì)胞增殖、凋亡、分化和礦化的影響，并深入探討成骨細(xì)胞的力學(xué)信號響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步研究力學(xué)條件下骨發(fā)生、重建的生物學(xué)機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.應(yīng)用四點彎曲力學(xué)加載裝置對小鼠成骨細(xì)胞系MC3T3-E1細(xì)胞施加頻率為0.5 Hz，不同強(qiáng)度(500με、

4、1000με、2000με、3000με、5000με)的力學(xué)拉伸應(yīng)變，力學(xué)拉伸結(jié)束后采用MTT實驗檢測細(xì)胞增殖情況、DNA ladder和流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況、RT-PCR和Western Blot檢測細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)情況、Von Kossa染色檢測細(xì)胞礦化情況。
　　 2.給MC3T3-E1細(xì)胞施加強(qiáng)度為2000με，頻率為0.5 HZ不同時間(2h、4h、8h、12h、24h)的力學(xué)拉伸應(yīng)變，拉伸結(jié)束后對成骨細(xì)胞

5、的增殖、凋亡、分化和礦化情況進(jìn)行檢測。
　　 3.采用RT-PCR和Western Blot方法檢測力學(xué)拉伸應(yīng)變對BMPs/Smad信號通路中各個分子表達(dá)的影響；采用ELISA方法檢測力學(xué)拉伸后成骨細(xì)胞培養(yǎng)基中BMP-2和BMP-4的含量；采用Western Blot方法檢測力學(xué)拉伸應(yīng)變對Smad蛋白的活化以及p-Smad向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移的影響。
　　 4.力學(xué)拉伸前2h以Noggin預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞，然后進(jìn)行8h

6、的力學(xué)拉伸，檢測阻斷BMPs通路對力學(xué)拉伸過程中Smad蛋白的活化以及成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響；力學(xué)拉伸前轉(zhuǎn)染Smad4 siRNA抑制Smad4的表達(dá)，然后進(jìn)行8h的力學(xué)拉伸，檢測力學(xué)拉伸后p-Smad的細(xì)胞核轉(zhuǎn)移情況以及成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)情況。
　　 5.采用Western Blot方法檢測力學(xué)拉伸后p38MAPK和NF-κB通路的活化情況；力學(xué)拉伸前以PDTC預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞，檢測阻斷NF-κB通路

7、對力學(xué)拉伸過程中BMPs表達(dá)的影響；力學(xué)拉伸前以Noggin預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞，檢測力學(xué)拉伸過程中p38MAPK的激活與BMPs信號的關(guān)系；力學(xué)拉伸前以SB203580預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞，檢測阻斷p38MAPK通路對力學(xué)拉伸過程中NF-κB通路的激活、BMPs的表達(dá)以及成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的影響。
　　 6.采用RT-PCR和Western Blot方法檢測力學(xué)拉伸應(yīng)變對Smurf1、Smurf2和CKIP-

8、1表達(dá)的影響。
　　 7.力學(xué)拉伸前轉(zhuǎn)染Smurf1 siRNA，然后進(jìn)行8h的力學(xué)拉伸，檢測抑制Smurf1的表達(dá)對力學(xué)拉伸過程中Smad、p-Smad以及成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響；力學(xué)拉伸前以MG132預(yù)處理MC3T3-E1細(xì)胞，檢測抑制蛋白酶體活性對力學(xué)拉伸過程中Smad和p-Smad的含量以及成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因表達(dá)的影響。
　　 實驗結(jié)果：
　　 1.1000με、2000με和3000με的力學(xué)

9、拉伸強(qiáng)度能促進(jìn)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)，其中2000με的作用最明顯，但各個力學(xué)拉伸強(qiáng)度均未影響成骨細(xì)胞的增殖、凋亡和礦化。
　　 2.2000με應(yīng)變強(qiáng)度下，不同時間的力學(xué)拉伸對成骨細(xì)胞增殖、凋亡和礦化沒有明顯作用。力學(xué)拉伸過程中成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因表達(dá)的上調(diào)有一定的時間依賴性：ALP的表達(dá)在力學(xué)拉伸4h時開始顯著升高，8h時表達(dá)最強(qiáng)，24h后恢復(fù)正常水平；OCN的表達(dá)在力學(xué)拉伸8h時開始顯著升高，并持續(xù)高表達(dá)至24h；而C

10、ol I的表達(dá)在力學(xué)拉伸4h時開始顯著上調(diào)，24h時表達(dá)水平仍高于對照組。
　　 3.力學(xué)拉伸應(yīng)變能夠促進(jìn)BMP-2和BMP-4的表達(dá)和分泌。BMPR I、Smad1和Smad5 mRNA表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化，但它們的蛋白水平在力學(xué)拉伸后升高。Smad1和Smad5在力學(xué)拉伸過程中被激活，且激活的Smad(p-Smad)在細(xì)胞核內(nèi)的含量升高。
　　 4.Noggin抑制了力學(xué)拉伸過程中Smad蛋白的活化，Smad4 si

11、RNA抑制了力學(xué)拉伸過程中p-Smad向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移。Noggin和Smad4 siRNA均能抑制力學(xué)拉伸過程中成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)。
　　 5.p38MAPK通路在力學(xué)拉伸15min被激活，NF-κB通路在力學(xué)拉伸30min被激活，它們均在力學(xué)拉伸90min后失活；PDTC阻斷NF-κB通路抑制了力學(xué)拉伸過程中BMP-2和BMP-4的表達(dá)；Noggin阻斷BMPs信號并未抑制力學(xué)拉伸過程中p38 MAPK通路的激活，表

12、明力學(xué)拉伸過程中p38 MAPK的激活不依賴于BMPs信號；SB203580阻斷p38 MAPK通路抑制了力學(xué)拉伸過程中NF-κB通路的活化、BMPs和成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，表明力學(xué)拉伸過程中NF-κB通路的活化以及BMPs的表達(dá)依賴于p38MAPK通路。
　　 6.力學(xué)拉伸應(yīng)變對Smurf2和CKIP-1的表達(dá)沒有明顯作用，但下調(diào)了Smurf1的表達(dá)。
　　 7.轉(zhuǎn)染Smurf1 siRNA和MG132預(yù)處理MC

13、3T3-E1細(xì)胞進(jìn)一步上調(diào)了力學(xué)拉伸過程中BMPR I和Smad蛋白的含量、Smad蛋白的激活以及成骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)。
　　 結(jié)論：
　　 1.力學(xué)拉伸應(yīng)變促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化。
　　 2.BMPs/Smad信號通路在力學(xué)拉伸過程中被激活，力學(xué)信號通過BMPs/Smad通路促進(jìn)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)。
　　 3.p38 MAPK通路和NF-κB通路在成骨細(xì)胞力學(xué)拉伸過程中存在偶聯(lián)，力學(xué)信號通過

14、p38 MAPKfNF-κB通路上調(diào)BMPs的表達(dá)，并進(jìn)一步激活BMPs/Smad通路誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因的表達(dá)。
　　 4.力學(xué)拉伸下調(diào)了Smurf1的表達(dá)并進(jìn)一步抑制了Smurf1介導(dǎo)的BMPR I和Smad蛋白的降解，Smurf1表達(dá)的下調(diào)促進(jìn)了力學(xué)拉伸過程中BMPs/Smad通路的活化。
　　 綜上所述，力學(xué)信號通過激活p38MAPK/NF-κB通路和下調(diào)Smurf1的表達(dá)促進(jìn)BMPs/Smad通路在力學(xué)拉伸