基底拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞生物力學效應的影響及其作用機制.pdf

1、目的：本文以生物力學為基礎，采用基底拉伸應變裝置，研究不同時間和周期的基底拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞生理活性和力學效應的影響。探討不同應變條件對小鼠MC3T3-E1細胞增殖活性、BMP-2 mRNA和蛋白表達的影響，并尋找差異性生物標志蛋白。
　　 方法：
　　 1.選用小鼠MC3T3-E1細胞，依據拉伸周期，隨機分為6組：A組，1次/d組；B組，2次/d組；C組，1次/d，2d組；D組，2次/d，2d組；E組，

2、1次/d，3d組；F組，2次/d，3d組；其中每組另設拉伸時間0.5h、1h、1.5h、2h。實驗中工作應變?yōu)?000μ∈，頻率為0.5Hz。采用MTT法，測定細胞增殖活性，選擇最佳拉伸時間。根據上述結果，設拉伸時間和周期為1次/d，每次1h，連續(xù)3d，頻率為0.5Hz；工作應變?yōu)?000μ∈、1500μ∈、2000μ∈、2500μ∈和5000μ∈，對小鼠MC3T3-E1細胞施加基底拉伸應變，通過MTT法和紫外分光光度法，研究不同拉伸應

3、變對細胞增殖活性和上清液中堿性磷酸酶（ALP）含量的影響。
　　 2.采用RT-PCR和Western-blot技術，研究工作應變?yōu)?μ∈、1000μ∈、1500μ∈、2000μ∈、2500μ∈和5000μ∈，頻率為0.5Hz，拉伸時間為1次/d，每次1h，連續(xù)3d對小鼠MC3T3-E1細胞BMP-2 mRNA和蛋白表達水平的影響。
　　 3.拉伸時間和頻率不變，采用雙向凝膠電泳技術（2-DE），分析工作應變?yōu)?μ∈、2

4、500μ∈、5000μ∈對細胞蛋白質組表達的影響。
　　 結果：
　　 1.小鼠MC3T3-E1細胞的鑒定：通過HE、ALP染色和成骨細胞表面標志物-骨鈣素（BGP）免疫組化證實，小鼠MC3T3-E1具有成骨細胞的生物學特性。
　　 2.基底拉伸應變裝置的力學評價：基底拉伸應變裝置應變的大小，可以通過CD段的等彎矩區(qū)控制，對體外培養(yǎng)的貼壁細胞施加定量均勻應變，并可用電阻應變計和應變儀監(jiān)測。實驗證實，在細胞培養(yǎng)中，

5、該裝置完全能滿足對細胞施加各種應變的要求。
　　 3.基底拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞增殖活性和ALP含量的影響：（1）不同拉伸時間對細胞增殖活性的影響，MTT結果證實：A、B、C、D、E、F各周期應變組中，每組拉伸0.5h、1h細胞增殖活性呈上升趨勢，拉伸1.5h、2h細胞增殖活性呈下降趨勢。其中C組（0.234±0.030）和F組（0.338±0.026）拉伸1h與各自對照組（0.192±0.047）和（0.290±0

6、.055）相比，細胞增殖活性顯著增高；E組（0.313±0.039）拉伸1h與對照組（0.265±0.038）相比，細胞增殖活性顯著增高。（2）不同拉伸應變對細胞增殖活性影響的結果顯示：與0μ∈組（0.279±0.056）相比，1000μ∈（0.323±0.060）組和1500μ∈組（0.330±0.042）沒有統(tǒng)計學意義；2000μ∈組（0.346±0.059）和2500μ∈組（0.373±0.062）顯著促進細胞增殖；5000μ∈組

7、（0.213±0.019）顯著抑制細胞增殖。（3）不同拉伸應變對細胞ALP含量的影響，結果顯示：與0μ∈組（1.589±0.184）相比，2000μ∈組（2.069±0.143）和2500μ∈組（2.218±0.119）ALP的含量顯著增高；5000μ∈組（1.392±0.206）ALP的含量顯著降低，ALP含量結果與細胞增殖結果一致。
　　 4.基底拉伸應變對小鼠MC3T3-E1細胞BMP-2 mRNA及蛋白表達的影響：RT-

8、PCR結果顯示：與0μ∈組（0.5386±0.028）相比，1000μ∈組（0.5620±0.020）和1500μ∈組（0.6228±0.012）BMP-2 mRNA表達沒有統(tǒng)計學意義；2000μ∈組（0.7813±0.010）和2500μ∈組（0.8121±0.013）BMP-2 mRNA表達顯著上調；5000μ∈組（0.3878±0.003）BMP-2 mRNA表達顯著下調。Western-blot結果顯示：與0μ∈組（0.3217

9、±0.010）相比，2000μ∈組（0.3539±0.006）和2500μ∈組（0.3673±0.010）細胞BMP-2蛋白表達水平顯著上調；5000μ∈組（0.3044±0.007）細胞BMP-2蛋白表達水平顯著下調。
　　 5.蛋白組學實驗證實：0μ∈平均檢測到（549±11）個蛋白點，2500μ∈作用下平均檢測到（563±14）個蛋白點；5000μ∈作用下平均檢測到（574±14）個蛋白點。與0μ∈組相比，2500μ∈發(fā)現(xiàn)

10、14種差異蛋白的表達，其中2種蛋白在應變作用后降低，12種蛋白在應變作用后增高；5000μ∈發(fā)現(xiàn)9種差異蛋白的表達，其中2種蛋白在應變作用后降低，7種蛋白在應變作用后增高。
　　 結論：
　　 1.基底拉伸可以影響小鼠MC3T3-E1細胞的增殖活性，且增殖活性的高低與拉伸時間有關。生理范圍內小于2000μ∈的基底拉伸，不影響細胞的增殖活性和ALP的分泌；生理范圍內較高強度2000μ∈和2500μ∈基底拉伸可以明顯促進細胞

11、的增殖活性和ALP的分泌；超生理范圍5000μ∈基底拉伸可抑制細胞的增殖和ALP的分泌。
　　 2.生理范圍內2000μ∈、2500μ∈拉伸應變上調小鼠MC3T3-E1細胞BMP-2 mRNA和蛋白表達，5000μ∈下調細胞BMP-2mRNA和蛋白表達?；桌鞈兛赡苁峭ㄟ^改變細胞中BMP-2 mRNA和蛋白表達，而影響細胞的增殖和ALP分泌。
　　 3.基底拉伸可導致小鼠MC3T3-E1細胞蛋白質組發(fā)生變化。相同時間