優(yōu)質(zhì)雞ALV-B-D-E受體基因tvb遺傳多樣性分析及其突變位點的功能驗證.pdf

1、禽白血?。ˋL）是由禽白血病病毒（ALV）引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主的多種腫瘤性疾病，是嚴(yán)重危害我國養(yǎng)禽業(yè)的主要疾病之一。到目前為止仍無有效防治的藥物和疫苗，僅通過淘汰陽性雞來控制該病。因此，全面了解禽白血病的流行情況，并從宿主遺傳抗性角度進(jìn)行研究對有效防控該病具有重要的意義。
　　1、本研究應(yīng)用病毒分離、ELISA和RT-PCR等方法對廣東省5個不同大型種雞場共29948份樣品進(jìn)行禽白血病流行病學(xué)調(diào)查，共檢測到171份陽性樣品

2、，總體陽性率為0.58％；其中J亞群陽性率占92.98%，A/B/J亞群混合感染陽性率僅占7.02%。
　　2、本研究對分離的10株ALV-J毒株的gp85和U3進(jìn)行序列分析，結(jié)果表明，ALV-J在不斷的發(fā)生變異，gp85與 HPRS103毒株同源性為93.6~96%，U3區(qū)與HPRS103同源性為90.6%~96.9%；基因變異十分迅速，某些堿基的改變或缺失對病毒致病力和傳播力等的影響有待進(jìn)一步研究。
　　3、本研究對42

3、個不同品系雞ALV-B/D/E受體基因tvb進(jìn)行測序和遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在白來航雞中已報道的突變位點 tvbr1（mRNA172 C>T）、tvbs3（mRNA184 T>A）和tvbr2（mRNA374G>C）存在于少數(shù)雞種中；商品優(yōu)質(zhì)雞中普遍存在tvbr3（mRNA298 C>T）突變位點。各品種間tvb基因突變位點的基因型頻率差異較大。
　　4、本研究對變異位點tvbr3（mRNA298C>T）進(jìn)行功能驗證。（1）細(xì)

4、胞感染性試驗：通過引入 EGFP熒光基團構(gòu)建 ALV-B/D/E報告病毒表達(dá)載體，并拯救出RCASBP(B/D/E)-EGFP病毒。用該病毒分別感染野生型CEF（tvbs1s1），雜合突變型CEF（tvbs1r3）和純合突變型 CEF（tvbr3r3），用流式細(xì)胞儀檢測不同基因型 CEF的EGFP陽性率。結(jié)果表明：tvbs1s1基因型細(xì)胞對 RCASBP(B/D/E)-EGFP病毒易感，而tvbr3r3純合突變型CEF對RCASBP(B

5、/D/E)-EGFP病毒的易感性降低，表明tvbr3突變使宿主對RCASBP(B/D/E)-EGFP病毒的感染產(chǎn)生遺傳抗性。（2）體內(nèi)動物試驗：將tvbr3突變野生型、雜合突變型和純合突變型的1日齡小雞隨機分組，飼養(yǎng)于隔離器，1日齡和5日齡分別腹腔注射ALV-B，攻毒1個月后，采集各組小雞的血樣，利用細(xì)胞病毒分離和RT-PCR等方法檢測病毒血癥，結(jié)果表明：tvbr3突變降低宿主對ALV-B野毒的易感性，從而產(chǎn)生遺傳抗性。
　　5、

6、本研究對流行病學(xué)調(diào)查中5個種雞場的23個品系雞進(jìn)行ALV-B/D/E受體基因tvb的遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示：這23個品系雞ALV-B/D/E受體基因tvb普遍存在tvbr3（mRNA298 C>T）突變位點，且該突變基因型頻率高達(dá)34~100%。與流行病學(xué)調(diào)查中 AB亞群 ALV陽性率僅僅占7.02%的結(jié)果相對應(yīng)。進(jìn)一步證明 tvbr3（mRNA298 C>T）突變位點具有遺傳抗性。
　　本研究在禽白血病的流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，