鼠成年新皮層神經(jīng)元的培養(yǎng)和缺糖缺氧實(shí)驗(yàn)方法研究及LPA調(diào)節(jié)腦糖異生的信號(hào)途徑的探討.pdf

1、一、目的：從成年動(dòng)物分離的神經(jīng)元的成功培養(yǎng)相當(dāng)困難,其中新皮層成年神經(jīng)元的體外培養(yǎng)更加困難,因此用于研究神經(jīng)生理的原代培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞一般限于胚胎或年輕神經(jīng)元。然而,胚胎或年輕神經(jīng)元并不是研究年齡相關(guān)生理機(jī)制與遲發(fā)性疾病的最佳細(xì)胞。最近的一些文獻(xiàn)說明,成年神經(jīng)元也能在體外培養(yǎng)成活。這里我們報(bào)道一個(gè)從成年鼠腦新皮層獲得的神經(jīng)元體能在外培養(yǎng)成功的方法。在獲得單個(gè)神經(jīng)元的過程中,神經(jīng)元遭受機(jī)械、化學(xué)消化以及缺氧等損害,細(xì)胞出現(xiàn)代謝及功能障礙,

2、細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)水腫、破碎,神經(jīng)元的粘附能力以及細(xì)胞活性也會(huì)下降。因此我們推測(cè)減輕水腫、促進(jìn)細(xì)胞粘附會(huì)有效改善細(xì)胞體外培養(yǎng)。白蛋白具有減輕水腫與結(jié)合多種有機(jī)物質(zhì)的能力。因此我們推測(cè)減輕細(xì)胞水腫、提高細(xì)胞粘附能力有助于神經(jīng)元的體外生存。由于白蛋白具有以上兩種功能,我們進(jìn)而推測(cè)白蛋白具有改善神經(jīng)元培養(yǎng)的能力。 方法：0.05％-1％牛血清白蛋白成分V用于神經(jīng)元培養(yǎng),研究不同濃度的白蛋白對(duì)神經(jīng)元活力、粘附細(xì)胞數(shù)的影響。 結(jié)果：0.1

3、-0.5％牛血清白蛋白能有效的促進(jìn)細(xì)胞粘附、提高細(xì)胞活力。7天培養(yǎng)后,我們能獲得90％純度的成年皮層神經(jīng)元。 結(jié)論：適當(dāng)濃度的牛血清白蛋白成分V能有效的促進(jìn)細(xì)胞粘附、提高細(xì)胞活力。 二、目的：氧糖剝奪試驗(yàn)(Oxygen and glucose deprivation,OGD)是體外研究缺血的公認(rèn)模型,這一模型已廣泛應(yīng)用于研究心腦缺血機(jī)制。然而,經(jīng)過數(shù)十年的改進(jìn),盡管實(shí)驗(yàn)方法越來越簡(jiǎn)單、易于操作,而且。但由于標(biāo)準(zhǔn)不一,在進(jìn)

4、行部分缺氧或者不同程度缺氧程度實(shí)驗(yàn)中,同樣濃度的低氧環(huán)境,不同的實(shí)驗(yàn)者描述的缺氧時(shí)間常會(huì)不一致。由于氧濃度不同,對(duì)細(xì)胞的影響不同。低氧會(huì)刺激細(xì)胞生長(zhǎng),而缺氧會(huì)造成細(xì)胞損害。這些混亂讓讀者無法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行精確的結(jié)果評(píng)價(jià)。因此,對(duì)缺氧程度、時(shí)間的精確描述有助于OGD試驗(yàn)結(jié)果的描述?？紤]到體外缺氧試驗(yàn)進(jìn)行時(shí),細(xì)胞或組織利用的氧氣實(shí)際是溶解在培養(yǎng)基中的溶解氧,因此我們以溶解氧分壓高低作為缺氧程度的指標(biāo),并以到達(dá)缺氧標(biāo)準(zhǔn)時(shí)間點(diǎn)開始計(jì)算時(shí)間。

5、 方法：在同一濃度氧與培養(yǎng)基數(shù)量一致環(huán)境下,檢測(cè)不同數(shù)量培養(yǎng)細(xì)胞形成的溶解氧分壓從正常氧分壓下降到缺氧氧分壓標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間曲線；在同一濃度氧與培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)量一致環(huán)境下,檢測(cè)不同數(shù)量培養(yǎng)基形成溶解氧分壓從正常氧分壓下降到缺氧氧分壓標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間曲線； 結(jié)果：在到達(dá)缺氧標(biāo)準(zhǔn)之前,細(xì)胞數(shù)多的溶解氧分壓下降比細(xì)胞數(shù)少的快；培養(yǎng)基體積少的溶解氧分壓比體積多的下降快。但最后都會(huì)下降亦較為恒定的平臺(tái)期。 結(jié)論：缺氧的時(shí)間應(yīng)該從測(cè)到溶液中氧

6、分壓達(dá)到缺氧標(biāo)準(zhǔn)開始計(jì)時(shí)。而缺氧前的時(shí)間為低氧刺激時(shí)間而不是缺氧時(shí)間。只有先進(jìn)行“定量細(xì)胞-定量培養(yǎng)基-溶解氧分壓-時(shí)間”預(yù)實(shí)驗(yàn),找出達(dá)到預(yù)定缺氧分壓得時(shí)間點(diǎn),才能精確決定缺氧時(shí)間長(zhǎng)短。 三、高血糖是預(yù)測(cè)缺血性或出血腦中風(fēng)的住院病人發(fā)病和/或致死的一個(gè)獨(dú)立因素。導(dǎo)致高血糖癥的機(jī)制并不十分清楚,但研究顯示異常糖異生是原因之一。傳統(tǒng)的概念認(rèn)為，腦不能進(jìn)行糖異生。但近年來的研究表明：腦星型膠質(zhì)細(xì)胞能利用乳酸,表達(dá)控制糖異生的關(guān)鍵酶。因

7、此，推測(cè)腦中風(fēng)時(shí)星型膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行糖異生是導(dǎo)致高血糖癥的原因之一?？紤]到腦中風(fēng)疾病不但導(dǎo)致血糖升高,還導(dǎo)致血中溶血磷脂酸(LPA,Lysophosphatidic Acid)升高值,且LPA是導(dǎo)致高血糖癥病人胰島素抵抗的原因之一。為進(jìn)一步推測(cè)LPA會(huì)調(diào)節(jié)腦星型膠質(zhì)細(xì)胞的糖異生,將培養(yǎng)的星型膠質(zhì)細(xì)胞在糖剝脫的條件下處理,細(xì)胞分未加與不加LPA組。并對(duì)各組予以細(xì)胞信號(hào)阻斷劑分別處理。結(jié)果顯示：在剝奪糖的培養(yǎng)中：沒有LPA細(xì)胞也能表達(dá)G6Pas

8、e,這一表達(dá)不會(huì)被Bis、Xes-C或Xes-C+Bis阻斷,但會(huì)被PTX與Neomycin阻斷；加入LPA情況與不加LPA完全一樣。結(jié)果還顯示：有糖培養(yǎng)時(shí)，無LPA時(shí)G6Pase并不表達(dá),PTX、Neomycin以及Bis均不能刺激G9Pase的表達(dá),但加入Xes-C或Xes-C+Bis時(shí)細(xì)胞會(huì)表達(dá)G6Pase;LPA可以刺激G6Pase的表達(dá),而且該表達(dá)可以被Bis、Xes-C以及Bis+Xes-C阻斷,但不被PTX或Neomyci