JIP3調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元放射狀遷移的研究.pdf

1、背景：
　　大腦皮層是大腦中最大的結(jié)構(gòu)，它由很多神經(jīng)元構(gòu)成。大腦皮層是大腦結(jié)構(gòu)中最為復雜的區(qū)域，發(fā)育完全的大腦皮層可以形成高度有序的六層層狀結(jié)構(gòu)。皮層形成的六層獨特結(jié)構(gòu)由不同形態(tài)及功能的細胞構(gòu)成，其對于皮層神經(jīng)環(huán)路形成、認知功能、情感以及意識都具有重要的作用。因此，在發(fā)育過程中，新生的神經(jīng)元準確的遷移到其最終的位置對于實現(xiàn)大腦的諸多功能是至關(guān)重要的，例如對于形成皮層精確的層狀結(jié)構(gòu)以及后續(xù)神經(jīng)環(huán)路的形成都是必不可少的。已有研究證實，

2、皮層神經(jīng)元可以從室管膜區(qū)/室管膜下區(qū)的神經(jīng)前體細胞分裂產(chǎn)生，然后沿著放射性膠質(zhì)細胞進行放射狀遷移，通過intermediatezone到達發(fā)育中的corticalplate。目前對于皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制研究，已有很多信號通路如reelin信號通路、JNK信號通路等被報道參與到神經(jīng)元的遷移，但具體參與調(diào)控的分子機制仍在繼續(xù)研究。
　　JIP3是JNK信號通路的一個支架蛋白，它在成年的大腦中有高表達。在老鼠腦內(nèi)敲除JIP3會導致

3、發(fā)育期的端腦連接缺失。JIP3還可以通過調(diào)控FAK影響癌細胞的運動能力。然而，作為JNK的支架蛋白，JIP3在皮層的發(fā)育過程中是否會參與神經(jīng)元的遷移還沒有研究過。
　　在我們的研究中，我們利用胚胎宮內(nèi)電轉(zhuǎn)干擾JIP3在即將分化為皮層神經(jīng)元的神經(jīng)前體細胞中的表達，從而證實了JIP3在皮層神經(jīng)元放射狀遷移過程中的作用。我們發(fā)現(xiàn)，干擾JIP3的表達之后可以破壞神經(jīng)元的遷移，進一步長時程觀察出生后的電轉(zhuǎn)小鼠證實JIP3對皮層神經(jīng)元放射狀遷

4、移的影響是一種延緩的效應。最后，我們通過共轉(zhuǎn)siJIP3和JIP3不同結(jié)構(gòu)域缺失突變體，研究JIP3調(diào)控神經(jīng)元放射狀遷移的關(guān)鍵功能域，以此研究調(diào)控皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制。我們的結(jié)果顯示，JIP3介導kinesin轉(zhuǎn)運的KBD和LZ結(jié)構(gòu)域?qū)τ谏窠?jīng)元遷移具有重要的作用。這些結(jié)果證實，在皮層發(fā)育過程中中JIP3對神經(jīng)元放射狀遷移發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。
　　目的:
　　1.探討JIP3與大腦皮層發(fā)育的關(guān)系，進一步證實JIP3對于

5、皮層神經(jīng)元放射狀遷移的作用。
　　2.研究JIP3調(diào)控皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制，為理解皮層發(fā)育提供新的理論。
　　方法:
　　1.蛋白印跡實驗
　　將不同發(fā)育時期的小鼠皮層分離出來，用裂解液勻漿處理后提取蛋白樣品。蛋白樣在95℃煮5min，然后用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。經(jīng)過抗體孵育、顯色之后分析結(jié)果。
　　2.胚胎宮內(nèi)電轉(zhuǎn)
　　懷孕15.5天的孕鼠用戊巴比妥鈉

6、腹腔注射麻醉，5-10min之后，將已麻醉的老鼠腹部向上放置在操作臺上。沿著腹部中線在腹部剪開外皮及內(nèi)皮，開口2cm左右。將中部有橢圓形開口的紗布覆蓋在孕鼠腹部。用鑷子將胚胎拉出，將子宮左右兩側(cè)的胎鼠分別放置在紗布的左右兩側(cè)，用預熱的生理鹽水浸潤胚胎，防止其變干。將含有0.1％ Fast Green、濃度為1.5ug/ul的質(zhì)粒用微注射管注射到腦室中，用電極夾持住胎鼠頭部進行電轉(zhuǎn)。這個電轉(zhuǎn)過程要在40min之內(nèi)完成，并將胚胎塞回子宮內(nèi)，

7、并將手術(shù)開口進行縫合。將手術(shù)完成的孕鼠放置在能維持體溫的環(huán)境中直至老鼠恢復意識。
　　3.質(zhì)粒構(gòu)建
　　JIP3小干擾RNA的序列插入到U6啟動子的下游，其靶向的序列是:CAGGCC GAG GAG AAA TTC A。干擾效率是在HEK-293細胞中分別電轉(zhuǎn)干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒測定的。帶有EGFP標簽的JIP3-resistant質(zhì)粒通過點突變的方式構(gòu)建，突變的位點未改變原來氨基酸的序列。突變之后的序列是:CAaGCg GA

8、a GAG AAg TTC A。用于胚胎宮內(nèi)電轉(zhuǎn)的質(zhì)粒是以 pCAGIG-IRES-EGFP為載體。
　　4.免疫組織化學
　　取出的大腦在4％的多聚甲醛中固定，過夜后轉(zhuǎn)移至30％的蔗糖溶液中，直至腦沉至溶液底部表明組織以脫水完全。將大腦進行包埋冰凍處理后進行切片。切好的組織切片經(jīng)過抗體孵育之后進行顯微拍照，最終進行圖片處理及數(shù)據(jù)分析。
　　結(jié)果:
　　1.JIP3參與大腦皮層的發(fā)育
　　1.1 JIP3在

9、發(fā)育期和出生后的皮層表達譜
　　JIP3在胚胎期和出生后都有較高的表達，在E13-E17和P0之后兩個時間段，JIP3的蛋白水平都有明顯的增加。
　　1.2干擾JIP3的表達損害了皮層的六層層狀結(jié)構(gòu)
　　利用在端腦中條件性下調(diào)JIP3表達的轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)E19和成年的小鼠的大腦皮層的層狀結(jié)構(gòu)都變得紊亂。而且成年小鼠的皮層厚度變薄。
　　2.JIP3調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元的放射狀遷移
　　2.1、干擾JIP3不影響

10、神經(jīng)前體細胞的增殖
　　通過BrdU染色發(fā)現(xiàn)，干擾了JIP3之后處于分裂的細胞數(shù)目沒有受到影響。
　　2.2、干擾JIP3的表達不影響神經(jīng)元形態(tài)的極化狀態(tài)
　　分析在IZ區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)現(xiàn)，干擾JIP3之后對神經(jīng)元有多極向雙極轉(zhuǎn)化的過程沒有影響。
　　2.3、下調(diào)JIP3的表達損害了神經(jīng)元的遷移
　　使用干擾效率達到90％的小干擾RNA，電轉(zhuǎn)到E15.5的胎鼠腦內(nèi)。三天之后檢測神經(jīng)元的遷移情況發(fā)現(xiàn)，干擾JI

11、P3的表達之后，神經(jīng)元主要滯留在了IZ。
　　3.JIP3通過延遲神經(jīng)元的遷移來調(diào)節(jié)皮層的發(fā)育。
　　在E15.5進行胚胎電轉(zhuǎn)之后，在P0和P7取材，跟對照組相比發(fā)現(xiàn)，干擾JIP3之后神經(jīng)元遷移到上層的細胞數(shù)目仍不能達到對照組水平，但是神經(jīng)元仍處在不斷遷移的過程中。
　　4.JIP3調(diào)節(jié)皮層神經(jīng)元放射狀遷移的機制
　　我們共轉(zhuǎn)了JIP3-resistant和siJIP3兩種質(zhì)粒，干擾JIP3引起的皮層神經(jīng)元放射狀

12、遷移的缺陷得到了緩解。接下來，我們又將JIP3的不同結(jié)構(gòu)域的缺失突變體分別與siJIP3共轉(zhuǎn)，發(fā)現(xiàn)JIP3介導kinesin轉(zhuǎn)運貨物的KBD和LZ結(jié)構(gòu)域?qū)φ{(diào)控皮層神經(jīng)元放射狀遷移非常重要。
　　結(jié)論:
　　1.我們的研究得到JIP3在發(fā)育的皮層中的表達譜，在胚胎期缺失JIP3使皮層層狀結(jié)構(gòu)發(fā)生紊亂。
　　2.下調(diào)JIP3之后延遲了神經(jīng)元的遷移，而不影響神經(jīng)元形態(tài)的極化和神經(jīng)前體細胞的增殖。
　　3.JIP3結(jié)構(gòu)域