RUNX1T1在海馬放射狀膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化中的作用.pdf

1、RUNX1T1又稱為MTG8或ETO，作為重要的轉(zhuǎn)錄因子參與各個(gè)系統(tǒng)的發(fā)育調(diào)控。目前，RUNX1T1在白血病發(fā)病機(jī)制方面的研究較多，而在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用研究甚少，主要認(rèn)為該因子可作為共抑制子參與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中細(xì)胞的增殖和向神經(jīng)元分化。為研究RUNX1T1在海馬神經(jīng)再生中調(diào)控海馬放射狀膠質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)元分化的作用，本研究主要探討RUNX1T1在海馬神經(jīng)再生中所起的作用。
　　一目的：
　　觀察海馬神經(jīng)再生微環(huán)境刺激下，“激活

2、”的星形膠質(zhì)細(xì)胞自身發(fā)生的變化及對(duì)海馬神經(jīng)再生的影響；觀察切割穹窿海馬傘海馬中RUNX1T1 mRNA和蛋白表達(dá)的時(shí)相變化及其定位；體外模擬海馬神經(jīng)再生微環(huán)境，觀察海馬放射狀膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RUNX1T1以及向神經(jīng)元分化情況；體外沉默和過表達(dá)RUNX1T1后對(duì)海馬放射狀膠質(zhì)細(xì)胞分化為神經(jīng)元的影響；體內(nèi)沉默和過表達(dá) RUNX1T1后對(duì)海馬神經(jīng)再生的影響，明確RUNX1T1與海馬神經(jīng)再生的關(guān)系。
　　二方法：
　　（1）切割大鼠雙側(cè)

3、穹窿海馬傘并且制備正常及切割穹窿海馬傘海馬提取液；
　?。?）體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)膠質(zhì)，在培養(yǎng)液中加入正常及切割穹窿海馬傘海馬提取液，“激活”星形膠質(zhì)膠質(zhì)，檢測其共表達(dá)BLBP、Vimentin、Nestin、Sox2與GFAP的情況；
　?。?）制備“激活”的星形膠質(zhì)膠質(zhì)條件培養(yǎng)基，培養(yǎng)海馬NSCs，檢測NSCs的存活、遷移和分化為神經(jīng)元的情況；
　?。?）ELISA檢測條件培養(yǎng)基中聚集素蛋白（Clusterin，CLU

4、）的含量，體外檢測Clusterin蛋白誘導(dǎo)海馬NSCs向神經(jīng)元分化的情況；
　?。?）制備切割右側(cè)穹窿海馬傘大鼠模型，分別于術(shù)后第3d、7d、14d、21d、28d檢測RUNX1T1 mRNA和蛋白表達(dá)情況；
　?。?）體外培養(yǎng)海馬 RGCs，在培養(yǎng)液中加入正常和切割海馬提取液，觀察海馬提取液促進(jìn)RGCs表達(dá)RUNX1T1以及向神經(jīng)元分化的作用；
　?。?）將siRNA-RUNX1T1干擾慢病毒和LV-RUNX1T1

5、-overexpression過表達(dá)慢病毒分別轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的海馬RGCs中，檢測海馬RGCs中RUNX1T1 mRNA和蛋白表達(dá)，以及向神經(jīng)元分化情況；
　?。?）將siRNA-RUNX1T1干擾慢病毒注入切割穹窿海馬傘大鼠海馬齒狀回中，觀察海馬齒狀回中新生DCX陽性神經(jīng)元的情況；
　　（9）將LV-RUNX1T1-overexpression過表達(dá)慢病毒注入正常大鼠海馬齒狀回中，觀察海馬齒狀回中新生DCX陽性神經(jīng)元的情況

6、。
　　三結(jié)果：
　?。?）切割穹窿海馬傘大鼠海馬提取液“激活”的星形膠質(zhì)細(xì)胞，膠質(zhì)前體細(xì)胞的標(biāo)記物BLBP、Vimentin和神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記物Nestin、Sox2表達(dá)顯著增強(qiáng)，出現(xiàn)較多的Nestin+/GFAP+細(xì)胞和Sox2+/GFAP+細(xì)胞；
　　（2）“激活”星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的海馬神經(jīng)干細(xì)胞球，球內(nèi)細(xì)胞的存活和發(fā)育狀態(tài)明顯較好；在膜穿孔實(shí)驗(yàn)中，用“激活”星形膠質(zhì)細(xì)胞的條件培養(yǎng)基誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)干細(xì)

7、胞，其發(fā)生遷移的數(shù)量顯著較多；并出現(xiàn)更多數(shù)量的海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化成MAP-2陽性神經(jīng)元，且神經(jīng)元的突起也長而豐富；
　?。?）對(duì)制備的各組條件培養(yǎng)基進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果顯示切割組12h、24h、48h中的 Clusterin蛋白濃度均明顯高于對(duì)照組和正常組，其中切割24h組達(dá)到它們的4倍；利用Clusterin在體外誘導(dǎo)海馬神經(jīng)干細(xì)胞分化，觀察到Clusterin能明顯促進(jìn)更多的海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化，并且分化的神經(jīng)元與空

8、白對(duì)照組相比，其突起更長、更豐富；
　?。?）切割穹窿海馬傘后不同時(shí)間點(diǎn)，海馬組織中RUNX1T1的表達(dá)水平發(fā)生了變化，在切割3d組中RUNX1T1 mRNA和蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，并達(dá)到高峰，此后迅速下降；免疫熒光檢測進(jìn)一步顯示，在海馬齒狀回中RUNX1T1陽性細(xì)胞主要分布于顆粒下層，在正常組中僅見少量的 RUNX1T1陽性細(xì)胞，切割3d組中 RUNX1T1陽性細(xì)胞數(shù)迅速增加，并達(dá)到高峰，在7d組，RUNX1T1陽性細(xì)胞數(shù)逐漸減少

9、，21d組，基本恢復(fù)到正常水平；
　?。?）用切割穹窿海馬傘海馬提取液培養(yǎng)海馬RGCs，體外模擬海馬再生微環(huán)境，結(jié)果觀察到“激活”的海馬RGCs中RUNX1T1 mRNA和蛋白的表達(dá)量均明顯上調(diào)，分別約為2.9倍和2.4倍，并且更多的海馬RGCs可向MAP-2陽性神經(jīng)元分化；
　?。?）在RUNX1T1-RNAi有效地下調(diào)海馬RGCs中RUNX1T1的表達(dá)后，觀察到僅有3.20％±2.31%細(xì)胞分化成 MAP-2陽性神經(jīng)元，

10、明顯少于對(duì)照組和空病毒組，而且細(xì)胞突起也明顯較短、較少。相反，用過表達(dá)慢病毒LV4-RUNX1T1-overexpression轉(zhuǎn)染海馬 RGCs，上調(diào)海馬 RGCs中 RUNX1T1的表達(dá)，28.31%±5.05%細(xì)胞表達(dá)MAP-2，與對(duì)照組和空病毒組相比，陽性細(xì)胞數(shù)量明顯明顯增多，細(xì)胞突起顯著變長而豐富；
　　（7）將構(gòu)建的siRNA-RUNX1T1干擾慢病毒載體注入切割穹窿海馬傘海馬齒狀回中，檢測到海馬中RUNX1T mRN

11、A及蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)，海馬齒狀回中新生的DCX陽性神經(jīng)元數(shù)也明顯減少；而在正常海馬齒狀回中注射LV-RUNX1T1過表達(dá)慢病毒載體，上調(diào)RUNX1T mRNA及蛋白的表達(dá)，則觀察到更多的新生DCX陽性神經(jīng)元，細(xì)胞的突起更長更豐富。
　　四結(jié)論：
　?。?）切割穹窿海馬傘大鼠海馬提取液“激活”的星形膠質(zhì)細(xì)胞，高表達(dá)膠質(zhì)前體細(xì)胞標(biāo)記物和神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記物，逆轉(zhuǎn)化成放射狀膠質(zhì)細(xì)胞，具有胚胎源性；
　?。?）“激活”的星形膠質(zhì)

12、細(xì)胞可促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞存活、遷移和向神經(jīng)元分化；
　?。?）“激活”的星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌更多的 Clusterin蛋白，從而促進(jìn)海馬神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化；
　?。?）穹窿海馬傘切割后海馬內(nèi)RUNX1T1 mRNA和蛋白表達(dá)在早期呈短暫性上調(diào)，并定位于海馬齒狀回顆粒下層；
　?。?）切割穹窿海馬傘海馬提取液促進(jìn)RGCs上調(diào)RUNX1T1和向神經(jīng)元分化
　　（6）體外下調(diào)RGCs中RUNX1T1的表達(dá)，可抑制RGC