轉(zhuǎn)錄因子Sp1調(diào)控TopoⅡβ在SH-SY-5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化中的表達(dá).pdf

1、目的：應(yīng)用全反式維甲酸(all trans retinoic acid，ATRA)誘導(dǎo)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY-5Y細(xì)胞分化；并探討其向神經(jīng)元分化過(guò)程中拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(topoisomeraseⅡ，TopoⅡ)，即TopoⅡα，β的表達(dá)情況；進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子特化蛋白1(Specificity proteinl，Sp1)對(duì)TopoⅡβ基因表達(dá)調(diào)控的影響，以期深入了解神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元分化的作用機(jī)制。
　　方法：
　　1細(xì)胞

2、培養(yǎng)
　　SH-SY-5Y細(xì)胞用含10％胎牛血清、1％B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　2 ATRA對(duì)SH-SY-5Y細(xì)胞作用濃度的篩選
　　不同濃度的ATRA(1，5，10，25，50，100μmol/L)作用于人SH-SY-5Y細(xì)胞后，應(yīng)用四甲基偶氮唑藍(lán)(Methyl

3、thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法測(cè)定細(xì)胞光密度值(Optical density，OD)，計(jì)算生長(zhǎng)抑制率和半數(shù)抑制濃度(IC50)，做出生長(zhǎng)曲線，從而篩選ATRA對(duì)SH-SY-5Y細(xì)胞的作用濃度。
　　3 SH-SY-5Y細(xì)胞分化百分率的檢測(cè)
　　不同濃度的ATRA(1，5，10，25，50μmol/L)作用于人SH-SY-5Y細(xì)胞后，用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目、胞體直徑和突起長(zhǎng)度的變化，用圖

4、像分析軟件Image-Pro Plus6.0測(cè)量各組細(xì)胞誘導(dǎo)前后的變化。神經(jīng)干細(xì)胞分化標(biāo)準(zhǔn)為軸突延伸超過(guò)胞體直徑二倍以上，觀察時(shí)對(duì)每瓶細(xì)胞隨機(jī)選取5個(gè)不同視野共計(jì)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞分化百分率。
　　4細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察
　　倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變，檢測(cè)細(xì)胞分化情況。分為兩組：①正常對(duì)照組，傳代后正常培養(yǎng)細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中加入與誘導(dǎo)分化組ATRA相同濃度的二甲基亞砜(Dimethyl-sulfoxide，DMSO)，

5、即10μmol/LDMSO。②誘導(dǎo)分化組，傳代后換為條件培養(yǎng)基(含3％FBS、1％B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液)，并在培養(yǎng)基中加入10μmol/L ATRA。兩組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)(6h，24h，72h，120h)用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞細(xì)胞數(shù)目、胞體直徑和突起長(zhǎng)度的變化，用圖像分析軟件Image-Pro Plus6.0測(cè)量各組細(xì)胞誘導(dǎo)前后的變化。觀察時(shí)對(duì)每瓶細(xì)胞隨機(jī)選取5個(gè)不同視野共計(jì)200個(gè)細(xì)胞。

6、
　　5細(xì)胞周期觀察
　?、僬T導(dǎo)分化組：傳代后換條件培養(yǎng)液(含3％FBS、1％B27、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液)，并在培養(yǎng)基中加入10μmol/LATRA，培養(yǎng)72h后收細(xì)胞。②正常對(duì)照：傳代后正常培養(yǎng)細(xì)胞，并在培養(yǎng)基中加入與誘導(dǎo)組ATRA相同濃度的DMSO，即10μmol/L DMSO，培養(yǎng)3d后收細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的變化。
　　6逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Revers tr

7、anscription PCR，RT-PCR)
　　RT-PCR半定量檢測(cè)Sp1，TopoⅡα，TopoⅡβ mRNA在ATRA誘導(dǎo)細(xì)胞分化過(guò)程中的變化，并用計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。
　　7 Western blot檢測(cè)
　　Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞神經(jīng)元分化標(biāo)記物，微管相關(guān)蛋白2(Microtubule-associated protein2，MAP2)，Sp1，TopoⅡα，TopoⅡβ蛋白在

8、SH-SY-5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中的表達(dá)變化，并用凝膠圖像分析系統(tǒng)測(cè)定并計(jì)算各蛋白條帶的積分光密度同對(duì)應(yīng)β-actin積分光密度比值。
　　8染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)
　　檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1是否特異性結(jié)合于TopoⅡβ基因啟動(dòng)子GC盒，并對(duì)提取純化的DNA應(yīng)用RT-PCR進(jìn)行定量分析。
　　結(jié)果：
　　1 SH-SY-5Y細(xì)胞呈貼壁、簇狀生長(zhǎng)；

9、胞體小而圓，少數(shù)呈梭形，大多數(shù)為不規(guī)則的多邊形，伸出多個(gè)較短的神經(jīng)突起。
　　2 MTT結(jié)果顯示，不同濃度的ATRA(1、5、10、25、50、100μmol/L)作用于SH-SY-5Y細(xì)胞24h、48h、72h、96h、120h后可以抑制細(xì)胞的增殖，在lμmol/L～25μmol/L濃度范圍內(nèi)隨ATRA濃度的增加，抑制作用逐漸加強(qiáng)，且隨著ATRA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用也逐漸加強(qiáng)，與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

10、ATRA濃度為50μmol/L和100μmol/L誘導(dǎo)細(xì)胞分化時(shí)，總細(xì)胞數(shù)明顯減少。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，ATRA對(duì)SH-SY-5Y細(xì)胞的抑制作用在1μmol/L～25μmol/L內(nèi)呈時(shí)間-劑量依賴(lài)關(guān)系。根據(jù)不同藥物濃度下的OD值，繪制了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。應(yīng)用半數(shù)抑制濃度(IC50)計(jì)算軟件計(jì)算藥物ATRA對(duì)SH-SY-5Y細(xì)胞的IC50：第24h為34.259±2.183μmol/L；第48h為19.621±1.540μmol/L；第72h為10

11、.330±0.942μmol/L；第96h為7.876±0.625μmol/L；第120h為5.706±0.490μmol/L。
　　3細(xì)胞分化百分率檢測(cè)結(jié)果顯示，ATRA誘導(dǎo)SH-SY-5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，5、10、25μmol/L ATRA在誘導(dǎo)分化第6～72h細(xì)胞分化百分率逐漸增加，其中，10μmol/L ATRA在誘導(dǎo)分化的第72h，細(xì)胞分化百分率達(dá)到最高(78.540±2.037％)，即誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元的細(xì)胞數(shù)目

12、最多。因此，本文選用10μmol/L ATRA作用濃度，誘導(dǎo)細(xì)胞向神經(jīng)元分化，并繼續(xù)進(jìn)行下列實(shí)驗(yàn)研究。
　　4細(xì)胞分化形態(tài)學(xué)觀察與對(duì)照相比，誘導(dǎo)分化第6h，ATRA誘導(dǎo)分化組細(xì)胞數(shù)目和神經(jīng)突起長(zhǎng)度無(wú)明顯變化；誘導(dǎo)分化第72h，細(xì)胞數(shù)目減少，胞體聚集生長(zhǎng)，具有多個(gè)細(xì)長(zhǎng)神經(jīng)突起，且長(zhǎng)度明顯增長(zhǎng)，交織成網(wǎng)，具備成熟神經(jīng)元形態(tài)，誘導(dǎo)組各時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　5流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期顯示，SH-SY

13、-5Y細(xì)胞經(jīng)10μmol/LATRA誘導(dǎo)分化72h后，與正常對(duì)照組相比，G0/G1期細(xì)胞增加25.2％，G2/M期細(xì)胞降低24.7％，細(xì)胞增殖指數(shù)PI降低25.2％，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞周期的變化說(shuō)明，大多數(shù)細(xì)胞處于G0/G1期，細(xì)胞增殖受到明顯抑制。
　　6 RT-PCR結(jié)果顯示，TopoⅡα mRNA的表達(dá)在ATRA誘導(dǎo)分化的第6～72h逐漸減少；而Sp1與TopoⅡβ mRNA的表達(dá)在ATRA

14、誘導(dǎo)分化的第6～72h逐漸增加。培養(yǎng)基中加入Sp1的特異性抑制劑光輝霉素(MithramycinA)作用后，Sp1、TopoⅡα和TopoⅡβ mRNA均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。
　　7 Western blot結(jié)果顯示，在向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化過(guò)程中，神經(jīng)元特異標(biāo)記蛋白MAP2的表達(dá)逐漸增加，分化至72h表達(dá)量最高。TopoⅡα僅蛋白的表達(dá)在ATRA誘導(dǎo)分化的第6～72h逐漸減少；而Sp1與TopoⅡβ蛋白的表達(dá)在ATRA誘導(dǎo)分化的第6～72h

15、逐漸增加。培養(yǎng)基中加入MithramycinA作用后，Sp1、TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白質(zhì)均出現(xiàn)表達(dá)下調(diào)。
　　8染色質(zhì)免疫沉淀結(jié)果顯示，ATRA誘導(dǎo)SH-SY-5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，隨著誘導(dǎo)分化時(shí)間的進(jìn)行，特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子GC盒的Sp1蛋白表達(dá)逐漸增高。同時(shí)，培養(yǎng)基中加入Sp1特異性抑制劑MithramycinA作用后，特異性結(jié)合在TopoⅡβ基因啟動(dòng)子GC盒的Sp1蛋白表達(dá)逐漸降低。結(jié)果顯示，SH-

16、SY-5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，Sp1可促進(jìn)TopoⅡβ基因表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1應(yīng)用ATRA可誘導(dǎo)SH-SY-5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化，結(jié)果顯示5、10、25μmol/L ATRA在誘導(dǎo)分化第6～72h細(xì)胞分化百分率逐漸增加，其中，10μmol/L ATRA在誘導(dǎo)分化的第72h，細(xì)胞分化百分率達(dá)到最高。
　　2 SH-SY-5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，細(xì)胞周期的變化說(shuō)明大多數(shù)細(xì)胞被阻滯于G0/G1期，G2/M期細(xì)胞

17、顯著降低，細(xì)胞增殖受到明顯抑制，TopoⅡα mRNA及其蛋白的表達(dá)逐漸減低與細(xì)胞的增殖受到抑制有關(guān)。TopoⅡα的表達(dá)水平與細(xì)胞的分化程度呈反比。
　　3 SH-SY-5Y細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò)程中，Sp1，TopoⅡβ的mRNA及其蛋白的表達(dá)逐漸增加與神經(jīng)干細(xì)胞的分化密切相關(guān)，TopoⅡβ的表達(dá)水平與細(xì)胞的分化程度呈正比，即表達(dá)高者神經(jīng)元分化程度高。
　　4轉(zhuǎn)錄因子Sp1通過(guò)特異性的結(jié)合TopoⅡβ基因啟動(dòng)子的GC盒，上調(diào)T