紅花苷的分離鑒定及其對(duì)岡田酸致SH-SY5Y分化神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、紅花，為菊科紅花屬一年生草本植物紅花（Carthamus tinctorius L.）的干燥管狀花。現(xiàn)代藥理研究表明，紅花中的醌式查爾酮類化合物為其主要有效部位，紅花苷（carthamin）是紅花藥材的主要有效成分之一。本研究旨在考察紅花苷對(duì)阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）性神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用，為其臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　本論文以紅花藥材為原料，采用堿提酸沉、甲醇萃取、凝膠柱層析等方法進(jìn)行分離純化

2、獲得紅花苷，并通過(guò)UV、核磁共振圖譜等方法確證了其結(jié)構(gòu)；通過(guò)比色法測(cè)定了紅花紅色素（紅花苷粗品）的穩(wěn)定性；通過(guò)ABTS等方法考察了紅花苷的體外抗氧化活性；采用全反式維甲酸（ ATRA）誘導(dǎo)體外培養(yǎng)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞（SH-SY5Y），使其分化為成熟神經(jīng)元，以岡田酸（OA）處理復(fù)制神經(jīng)元突觸萎縮模型，探究紅花苷對(duì)岡田酸致Tau蛋白過(guò)磷酸化引起神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下：
　　（1）紅花藥材通過(guò)去離

3、子水清洗除雜，經(jīng)堿提酸沉、離心、冷凍干燥，甲醇萃取濃縮等步驟，再經(jīng)反復(fù)葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）柱層析，得到化合物紅花苷。經(jīng)HPLC法測(cè)定，其純度≥98％，最后對(duì)化合物進(jìn)行波譜（UV、1H-NMR、13C-NMR）檢測(cè)，鑒定該化合物即為紅花苷。
　　（2）通過(guò)對(duì)紅花苷的分析檢測(cè)方法的研究，確定了紅花苷的HPLC測(cè)定方法：色譜柱：XB-C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；色譜條件：流動(dòng)相：乙腈-甲醇-水（3

4、5：10：60）（pH值為3~4）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：518 nm；檢測(cè)時(shí)間20 min。進(jìn)樣量：20μL。經(jīng)方法學(xué)考察，驗(yàn)證此方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性好。
　?。?）以實(shí)驗(yàn)室提取所得紅花紅色素（紅花苷粗提物）為樣品，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法，對(duì)紅花紅色素穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，分別考察了溫度、pH值、光照、金屬離子等因素對(duì)其穩(wěn)定性的影響，研究發(fā)現(xiàn)紅色素在過(guò)酸或過(guò)堿溶液中穩(wěn)定性較差；在pH5~11范圍內(nèi)較穩(wěn)定；紅色

5、素?zé)岱€(wěn)定性較差，高溫使其顏色變淺，在偏堿性條件下耐熱性優(yōu)于酸性條件；紅色素對(duì)光穩(wěn)定；Fe3+、Fe2+、Cu2+、Al3+等對(duì)紅花紅色素穩(wěn)定性有明顯影響，引起其顏色變淺，穩(wěn)定性降低，而Ca2+、Zn2+、Mg2+等對(duì)其穩(wěn)定性影響較小。
　?。?）以實(shí)驗(yàn)室提取紅花苷為樣品，研究了其抗氧化作用，采用ABTS法和FRAP 法測(cè)定了紅花苷的總抗氧化能力，并分別測(cè)定了紅花苷對(duì)羥自由基（?OH）、超氧陰離子（O2-?）、DPPH?自

6、由基的清除能力，實(shí)驗(yàn)表明，紅花苷能清除自由基，具有較好的抗氧化能力，并且隨著濃度增加，逐漸增強(qiáng)。
　　（5）采用體外培養(yǎng)SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的方法，經(jīng)10μmol/L ATRA誘導(dǎo)處理4天，誘導(dǎo)細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元，誘導(dǎo)后細(xì)胞突觸明顯增長(zhǎng)。隨后用40 nmol/L OA處理分化神經(jīng)元6 h，導(dǎo)致神經(jīng)元突觸明顯萎縮，Tau蛋白Ser262位點(diǎn)磷酸化水平明顯升高。采用濃度為10~50μmol/L的紅花苷與岡田酸共同處理6 h