BDNF增加JIP3表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景:
　　除了可促進(jìn)神經(jīng)元存活和分化，BDNF在調(diào)節(jié)突觸可塑性中也起重要作用。它可以使大腦在發(fā)育過程中形成新的神經(jīng)環(huán)路，并在成年后影響諸如學(xué)習(xí)、記憶和行為等高級(jí)活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF在短時(shí)和長時(shí)過程中對(duì)突觸前和突觸后的可塑性都有作用。急性BDNF刺激可以通過增強(qiáng)海馬突觸前去極化引起谷氨酸釋放來調(diào)節(jié)突觸轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí)，在突觸后位置，BDNF快速激活包括Na+、K+通道在內(nèi)的離子通道，也增強(qiáng)NMDA受體和AMPA受體。這些快速的突

2、觸前突觸后調(diào)節(jié)過程主要通過磷酸化激活蛋白實(shí)現(xiàn)，但這些激活大部分都是瞬時(shí)的。長時(shí)間BDNF處理，最初的作用是持續(xù)性的突觸調(diào)節(jié)，包括增強(qiáng)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放，增加突觸后樹突棘密度，促進(jìn)樹突棘成熟，這些過程都需要新的蛋白合成。然而，在這個(gè)過程中，特別是突觸前位置，BDNF引起哪些新蛋白合成，并參與到這些過程還不清楚。
　　JIP3(c-Jun NH2-terminal kinase(JNK)-interacting protein3）在發(fā)

3、育過程和成年大腦中都有表達(dá)，最早被發(fā)現(xiàn)可作為JNK信號(hào)通路的支架蛋白。此外，JIP3在果蠅中的同源蛋白叫做Sunday Driver(SYD)，在秀麗隱桿線蟲則為UNC-16，它們可以作為支架蛋白調(diào)節(jié)軸突中突觸囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)。最近JIP3也被報(bào)道在大鼠中可作為TrkB順軸突轉(zhuǎn)運(yùn)的銜接蛋白。
　　值得注意的是，先前的研究報(bào)道了另一個(gè)神經(jīng)營養(yǎng)因子NGF可以在分化的PC12細(xì)胞中上調(diào)JIP3的表達(dá)。對(duì)比之前的研究發(fā)現(xiàn)JIP3主要在皮層和海馬表

4、達(dá)，而BDNF也在這些區(qū)域高表達(dá)，猜想BDNF是否能夠調(diào)節(jié)JIP3表達(dá)。在本研究中，發(fā)現(xiàn)BDNF/TrkB信號(hào)通路可以通過激活CREB增加JIP3蛋白合成，進(jìn)而促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
　　研究目的:
　　初步探討B(tài)DNF信號(hào)通路增強(qiáng)長時(shí)程突觸前可塑性的機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.BDNF對(duì)JIP3蛋白水平的影響
　　向體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，分別加入BDNF刺激1h、2h、4h、8h、12 h和24 h，W

5、estern Blot檢測不同時(shí)間點(diǎn)JIP3蛋白水平的變化。同時(shí)向體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，加入BDNF刺激，免疫細(xì)胞熒光染色檢測，以JIP3（紅色標(biāo)記）與α-Tubulin（綠色標(biāo)記）的比值標(biāo)示JIP3的相對(duì)含量。在BDNF+/-敲除小鼠中取材海馬腦區(qū)，使用Western Blot檢測內(nèi)源性BDNF減少對(duì)JIP3蛋白水平變化的影響。
　　2.應(yīng)用BDNF受體抑制劑和蛋白合成降解抑制劑檢測BDNF調(diào)控JIP3蛋白水平變化機(jī)制

6、　　向體外原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中，分別加入K252a和Pep5抑制BDNF的受體TrkB和P75，再加入BDNF刺激，應(yīng)用Western Blot檢測JIP3蛋白變化。在神經(jīng)元中分別加入蛋白合成的抑制劑和蛋白降解的抑制劑，再加入BDNF刺激，用Western Blot檢測JIP3蛋白變化。分別用BDNF刺激15 min、30 min、60min、2h、3h、4h，提取神經(jīng)元RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA后用RealTime PCR檢測JIP3

7、mRNA的變化。
　　3.驗(yàn)證CREB在BDNF增加JIP3蛋白水平過程中的作用
　　向培養(yǎng)的神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入CREB抑制劑抑制CREB發(fā)揮作用，再加入BDNF刺激，Western Blot檢測神經(jīng)元中JIP3蛋白含量。進(jìn)一步，在神經(jīng)元中過表達(dá)持續(xù)失活型CREB來阻斷內(nèi)源性CREB的作用，再加入BDNF刺激，用Western Blot檢測JIP3蛋白水平的變化。使用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)的方法，用CREB抗體將所有

8、與CREB結(jié)合的DNA片段富集起來，用PCR的手段檢測分別檢測無BDNF時(shí)和有BDNF時(shí)CREB是否結(jié)合JIP3的啟動(dòng)子。
　　4.JIP3啟動(dòng)子上CRE位點(diǎn)分析
　　將JIP3啟動(dòng)子分別截短突變接到Luciferase報(bào)告基因載體pGL3-basic上，轉(zhuǎn)染到神經(jīng)元中，再加入BDNF刺激，用酶標(biāo)儀檢測不同突變體的熒光值。進(jìn)一步，在可能存在CRE的區(qū)域，分別將預(yù)測的CRE位點(diǎn)缺失突變，再連接到pGL3-basic上，同樣加B

9、DNF刺激后檢測不同突變體的熒光值。最后將含有缺失CRE位點(diǎn)的JIP3啟動(dòng)子質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至293細(xì)胞，用全長型啟動(dòng)子做對(duì)照，ChIP檢測CREB是否與之結(jié)合。
　　5.FM1-43活細(xì)胞染色檢測JIP3對(duì)BDNF增強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的影響
　　在培養(yǎng)的神經(jīng)元中，轉(zhuǎn)染JIP3 siRNA載體干擾JIP3，用FM1-43活細(xì)胞染色檢測神經(jīng)元釋放的囊泡數(shù)量，再加BDNF刺激4h，檢測囊泡釋放數(shù)目的變化。
　　研究結(jié)果:
　　1

10、.BDNF在體內(nèi)和體外環(huán)境均可調(diào)節(jié)JIP3蛋白水平
　　向培養(yǎng)7天的海馬神經(jīng)元培養(yǎng)液中，加入BDNF刺激不同時(shí)間點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)2h后JIP3蛋白水平有增加的趨勢，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在4 h JIP3蛋白水平有顯著提高，并在12 h到達(dá)最高水平并持續(xù)。用BDNF對(duì)培養(yǎng)7天的神經(jīng)元刺激4h，進(jìn)行免疫熒光染色，紅色標(biāo)記JIP3，綠色標(biāo)記α-Tubulin，用JIP3熒光強(qiáng)度比α-Tubulin得到JIP3相對(duì)含量，結(jié)果BDNF刺激4h實(shí)驗(yàn)組J

11、IP3相對(duì)含量明顯高于溶劑對(duì)照組。取BDNF+/-和WT小鼠海馬組織，用Western Blot檢測其中JIP3蛋白水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BDNF+/-小鼠JIP3蛋白水平明顯低于WT小鼠。
　　2.BDNF通過TrkB信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)節(jié)JIP3蛋白水平
　　向培養(yǎng)7天的海馬神經(jīng)元中，分別加入K252a和Pep5，分別抑制TrkB和P75受體，30 min后加入BDNF刺激4h，結(jié)果K252a抑制TrkB后JIP3蛋白水平有明顯

12、下降，并且加入BDNF后也不再增加，而Pep5組與對(duì)照組一致。向神經(jīng)元中分別加入蛋白合成的抑制劑CHX，和蛋白降解的抑制劑L/P+MG132，再加入BDNF刺激4h，Western Blot檢測JIP3蛋白水平，發(fā)現(xiàn)在加入CHX后，基礎(chǔ)狀態(tài)下JIP3蛋白水平有所降低，加入BDNF后也不再升高;加入蛋白降解抑制劑后，基礎(chǔ)狀態(tài)下JIP3蛋白水平上升，加入BDNF后，JIP3依然有明顯上調(diào)。加入BDNF刺激海馬神經(jīng)元不同時(shí)間點(diǎn)，取神經(jīng)元總RN

13、A反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，RealTime PCR檢測JIP3 mRNA發(fā)現(xiàn)，在2h時(shí)，JIP3 mRNA有明顯上調(diào)并持續(xù)。
　　3.BDNF通過激活CREB增加JIP3蛋白水平
　　在用BDNF刺激海馬神經(jīng)元30 min前，向培養(yǎng)液中加入CREB抑制劑，Western Blot檢測JIP3蛋白水平發(fā)現(xiàn)，在不加BDNF時(shí)，加入CREB抑制劑使JIP3蛋白水平下降，而加入BDNF后JIP3也不再增加。用慢病毒轉(zhuǎn)染神經(jīng)元分別過表達(dá)V

14、MT型CREB和持續(xù)失活型CREB(CREB S/A)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)持續(xù)失活型后JIP3蛋白水平降低，且加入BDNF后也不再升高。用CREB抗體免疫沉淀CREB分子和CREB結(jié)合的DNA片段，再用PCR技術(shù)檢測這些DNA片段中是否存在JIP3的啟動(dòng)子，結(jié)果在基礎(chǔ)狀態(tài)下，CREB與JIP3啟動(dòng)子結(jié)合，發(fā)現(xiàn)加入BDNF后CREB結(jié)合了更多的JIP3啟動(dòng)子。
　　4.JIP3啟動(dòng)子中CRE位點(diǎn)分析
　　將全長型、缺失前1300

15、bp、缺失前2300 bp的JIP3啟動(dòng)子連接到pGI3-basic載體，轉(zhuǎn)染到神經(jīng)元細(xì)胞，加入BDNF刺激，發(fā)現(xiàn)全長型啟動(dòng)子啟動(dòng)了一定強(qiáng)度熒光，而加入BDNF后增強(qiáng)了熒光;在缺失掉前1300 bp后，無論基礎(chǔ)狀態(tài)還是BDNF刺激條件下，熒光強(qiáng)度都有明顯下降且不再變化。進(jìn)一步，將前1300 bp中的CRE位點(diǎn)分別缺失突變，在進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因分析，發(fā)現(xiàn)在-3265至-3258位置缺失突變后，基礎(chǔ)狀態(tài)熒光強(qiáng)度有明顯下降，而加入BDNF后

16、也不再上升。再將包含該缺失突變體和全長型啟動(dòng)子的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，進(jìn)行ChIP分析，發(fā)現(xiàn)CREB已不再結(jié)合該突變體。
　　5.JIP3參與到BDNF增強(qiáng)的長時(shí)程神經(jīng)遞質(zhì)釋放
　　在培養(yǎng)的神經(jīng)元中，轉(zhuǎn)染JIP3 siRNA載體干擾JIP3，用FM1-43活細(xì)胞染色檢測神經(jīng)元釋放的囊泡數(shù)量，再加入BDNF刺激4h，檢測囊泡釋放數(shù)目的變化。對(duì)照組發(fā)現(xiàn)BDNF刺激后，遞質(zhì)囊泡釋放的數(shù)目變多，而干擾JIP3組經(jīng)過BDNF刺激后

17、，囊泡釋放數(shù)目雖有增加，但是增加的水平較對(duì)照組少。
　　研究結(jié)論：
　　1.BDNF在體內(nèi)和體外環(huán)境均可調(diào)節(jié)JIP3蛋白水平。
　　2.BDNF通過TrkB信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄途徑調(diào)節(jié)JIP3蛋白水平。
　　3.BDNF通過激活CREB增加JIP3蛋白水平。
　　4.JIP3參與到BDNF增強(qiáng)的長時(shí)程神經(jīng)遞質(zhì)釋放。
　　創(chuàng)新點(diǎn)：
　　1.發(fā)現(xiàn)了BDNF增加JIP3蛋白表達(dá)水平并研究了其機(jī)制。