BMSCs及補腦Ⅰ號含藥血清對缺氧缺糖海馬神經(jīng)元模型的保護作用及機制研究.pdf

1、目的：
　　我們推測AD的始動因素是血管基本功能缺失導(dǎo)致神經(jīng)功能逐漸受損，據(jù)此建立體外缺氧缺糖海馬神經(jīng)元細胞模型，模擬腦血管供氧氣供能量基本功能缺失后神經(jīng)元受損的模型。觀察骨髓間充質(zhì)干細胞、補腦Ⅰ號含藥血清對體外缺氧缺糖海馬神經(jīng)元模型的干預(yù)作用，使用免疫組化、Western blotting檢測NF200及ICAM-1蛋白表達情況，實時熒光定量PCR檢測NF200及ICAM-1相對基因表達量。通過分析以上數(shù)據(jù)，探討骨髓間充質(zhì)干細胞

2、、補腦Ⅰ號含藥血清對體外缺氧缺糖海馬神經(jīng)元模型所發(fā)揮的作用，并聯(lián)系中西醫(yī)理論分析其可能的原因。
　　方法：
　　利用4周大昆明種小鼠分離獲得骨髓間充質(zhì)干細胞，傳到第三代用于實驗研究;孕18-19天昆明種孕鼠的胎鼠，分離并用無血清培養(yǎng)技術(shù)獲得原代海馬神經(jīng)元;100只2個月大昆明種小鼠，通過每天灌胃1次，連續(xù)7天的，末次灌胃后2小時采取全血，離心，過濾，滅活，獲取正常血清和補腦Ⅰ號含藥血清;三氣培養(yǎng)箱(94％N2、5％CO2、1

3、％O2)，EBSS液，進行體外缺氧缺糖造模，模擬腦血管基本功能缺失后神經(jīng)元受損的模型，分1/2、1、2、3小時，MTT法篩選合適的造模時間;Transwell共培養(yǎng)小室建立體外BMSCs與缺氧缺糖海馬神經(jīng)元非直接接觸共培養(yǎng)模型，MTT法觀察BMSCs對缺氧缺糖海馬神經(jīng)元的影響;MTT法篩選BMSCs、補腦Ⅰ號含藥血清、補腦Ⅰ號含藥血清+BMSCs最佳干預(yù)濃度、最佳作用時間點，確定之后用于正式實驗;正式實驗分為7組:正常細胞組、模型組、模

4、型組+BMSCs、模型組+正常血清、模型組+正常血清+BMSCs、模型組+補腦Ⅰ號含藥血清組、模型組+補腦Ⅰ號含藥血清+BMSCs組，分別用免疫組化、Westernblotting檢測NF200及ICAM-1蛋白表達情況，實時熒光定量PCR檢測NF200及ICAM-1相對基因表達量。
　　結(jié)果：
　　獲得純度較高活性好的P3代BMSCs;分離胎鼠海馬組織使用無血清培養(yǎng)技術(shù)獲得高純度海馬神經(jīng)元細胞;三氣培養(yǎng)箱、EBSS液進行缺

5、氧缺糖1/2、1、2、3小時，MTT法篩選發(fā)現(xiàn)缺氧缺糖2小時為合適的造模時間，成功模擬腦血管供氧供能量基本功能缺失后神經(jīng)元受損的模型;建立了體外BMSCs與缺氧缺糖海馬神經(jīng)元細胞非直接接觸Transwell小室共培養(yǎng)模型;MTT法篩選BMSCs、補腦Ⅰ號含藥血清、補腦Ⅰ號含藥血清+BMSCs最佳干預(yù)濃度為10％（體積分數(shù)）及最佳作用時間點為72小時;與模型組比，模型組+BMSCs、模型組+正常血清+BMSCs、模型組+補腦Ⅰ號含藥血清組

6、、模型組+補腦Ⅰ號含藥血清+BMSCs組NF200蛋白表達量及NF200相對基因表達量均呈逐漸升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，正常血清+模型組的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，正常組NF200蛋白及基因的表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05);與模型組比較模型組+BMSCs、模型組+正常血清+BMSCs、模型組+補腦Ⅰ號含藥血清組、模型組+補腦Ⅰ號含藥血清+BMSCs組ICAM-1蛋白表達量及ICAM-1相對基因表達

7、量均呈逐漸降低的趨勢，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)，正常血清+模型組的變化無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，正常組ICAM-1蛋白及基因的表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.EBSS液、三氣(94％N2、5％CO2、1％O2)培養(yǎng)箱可以成功建立體外OGD模型，并可以模擬腦血管供氧供能量基本功能缺失后神經(jīng)元受損的模型;
　　2.單獨BMSCs、單獨補腦Ⅰ號含藥血清促使標(biāo)志神經(jīng)元再生的NF20

8、0表達增強，而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的ICAM-1表達下降，對海馬神經(jīng)元缺氧缺糖模型具有雙向保護作用;與單獨BMSCs組比，單獨補腦Ⅰ號含藥血清組的雙向保護作用更顯著;
　　3.補腦Ⅰ號含藥血清聯(lián)合BMSCs促使標(biāo)志神經(jīng)元再生的NF200表達顯著增強，而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的ICAM-1表達顯著下降，對海馬神經(jīng)元缺氧缺糖模型具有顯著的雙向保護作用;
　　4.正常血清對海馬神經(jīng)元缺氧缺糖模型的無保護作用。
　　5.在AD發(fā)生前期、早期使用