HPV6b、11型E7基因的克隆、表達及其融合蛋白在診斷尖銳濕疣中的應用價值.pdf

1、目的： 1.利用分子生物學技術構建原核表達重組質粒pET32a(+)/HPVGb E7和pET32a(+)/HPVll E7,并在大腸桿菌中表達HPVGb和11 E7融合蛋白. 2.制備HPV6b和11 E7融合蛋白診斷抗原,采用ELISA方法檢測尖銳濕疣患者血清和陰道分泌物抗體水平,研究該蛋白的抗原性,為HPV6b和11型感染的診斷研究奠定基礎. 方法： 1.利用HPV 6b和11型特異性引物,擴增HP

2、V6b和11型E7蛋白基因的全長序列,擴增產物分別定向插入到原核表達載體pET32a(+)中,分別構建重組質粒pET32a(+)/HPV6b E7和pET32a.(+)/HPVll E7,并經酶切和測序分析鑒定. 2.重組質粒pET32a(+)/HPV6b E7和pET32a(+)/HPVll E7分別轉化至E.ColiBL21(DE3)中,經誘導表達融合蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot方法分析鑒定.

3、 3.采用Ni-NTA hgarose親和層析柱純化HPV6b和11 E7融合蛋白,并以HPV6b和11型陽性血清作一抗,進一步用Western blot分析該融合蛋白的抗原性. 4.分別以純化的HPV6b和11 E7融合蛋白作診斷抗原,用間接ELISA法檢測尖銳濕疣患者(106例)、宮頸癌患者(43例)及健康對照者(98例)血清IgG抗體和CA患者(77例)、健康對照者(115例)陰道分泌物sIgA抗體.根據健康對照組血清及陰

4、道分泌物抗體的平均A值計算出陽性判定值(Cut off值)(健康對照組血清及陰道分泌物抗體平均A值+2S),以此評估尖銳濕疣患者的血清和陰道分泌物抗體陽性檢出率及ELISA方法診斷尖銳濕疣的敏感度和特異度;并分別比較HPV6b和11 E7融合蛋白血清及陰道分泌物抗體水平與HPV感染型別的關系,以分析基于目的蛋白的ELISA方法用于診斷HPV6b和11型感染的敏感度. 5.統(tǒng)計學分析:采用SPSS8.0統(tǒng)計軟件進行方差分析,進一步

5、兩兩比較用Tamhane法,各組間血清抗體陽性率的比較采用x<'2>檢驗法,顯著性檢驗水平均為0.05. 結果： 1.經酶切和測序證明成功構建pET32a(+)/HPV6b E7和pET32a(+)/HPV11 E7重組質粒;重組質粒分別在大腸桿菌E.Coli BL21(DE3)內成功表達了融合蛋白,經SDS-PAGE電泳分析見約30kDa大小的蛋白條帶,并經Western blot鑒定為目的蛋白,HPV6b和HPV11

6、 E7融合蛋白純化后通過核酸蛋白檢測儀檢測的濃度分別為40μg/ml和46μg/ml;分別以HPV6b E7和HPV11 E7陽性CA患者血清作一抗,經Western blot鑒定HPV6b E7和HPV11E7融合蛋白具有較強抗原性.成功制備并純化了用于CA診斷的ELISA抗原. 2.分別以HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白作為診斷抗原用,間接ELISA方法檢測CA患者、宮頸癌患者和健康對照者血清IgG抗體:①HPV6

7、b E7抗體均值分別為1.655±0.130、1.366±0.110和1.44±0.14;HPV11 E7抗體均值分別為1.545±0.131、0.586±0.155和0.674±0.150.CA組較宮頸癌組及健康對照組HPV6b E7和HPV11 E7抗體均值差異均有顯著性(P<0.01),而宮頸癌組較對照組抗體均值差異均無顯著性(P>0.05).②HPV6b E7抗體陽性率分別為67.9﹪(70/106)、13.9﹪(6/43)和7

8、.1﹪(7/98);HPV11 E7抗體陽性率、分別為75.5﹪(80/106)、11.6﹪(5/43)和7.1﹪(7/98).CA組較宮頸癌組及健康對照組HPV6bE7和HPV11 E7抗體陽性率差異均有顯著性(P<0.01)而宮頸癌組較對照組差異則均無顯著性(P>0.05).③CA組中女性患者HPV6b E7和HPV11E7抗體陽性率分別為73.3﹪(66/90)和82.5﹪(74/90),男性患者抗體陽性率分別為25﹪(4/16)

9、和37.5﹪(6/16).女性組均高于男性組(P<0.01).④基于HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白的ELISA用于檢測CA患者敏感度分別為67.9﹪(70/106)和75.5﹪(80/106);特異度均為92.9﹪(91/98). 3.分別以HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白作為診斷抗原,用間接ELISA方法檢測CA患者和健康對照者陰道分泌物sIgA抗體:①HPV6b E7抗體均值分別為0.061±0.01和

10、0.060±0.0047,HPV11 E7抗體均值分別為0.07±0.01和0.05±0.007.CA患者較健康對照組抗體均值差異均有顯著性(P<0.01).②HPV6bE7抗體陽性率分別為42.9﹪(33/77)和7.8﹪(9/115),HPV11 E7抗體陽性率分別為6.3﹪(28/77)和5.2﹪(6/115).CA組陽性率較健康對照組差異均有顯著性(P<0.01).③基于HPV6b E7和HPVII E7融合蛋白的ELISA用于

11、檢測CA患者敏感度分別為42.9﹪(33/77)和36.3﹪(28/77);特異度分別為92.2﹪(106/115)和94.8﹪(109/115). 4.76例CA患者濕疣組織和117例健康對照者陰道分泌物,用PCR方法檢測HPV6b和HPV11 DNA.結果:CA患者濕疣組織中HPV6b和HPV11型DNA陽性率分別為77.6﹪(59/76)和56.6﹪(43/76);健康對照者陰道分泌物中HPV6b和HPV11型DNA陽性率

12、分別為8.5﹪(10/117)和3.4﹪(4/117). 5.分別以HPV6b E7和HPV11 E7融合蛋白作為診斷抗原,用間接ELISA法分別對經選擇的HPV6 DNA陽性(44例)、HPV11DNA陽性(35例)血清和陰道分泌物抗體.結果,HPV6 E7血清IgG抗體陽性率分別為93.2﹪(41/44)和71.4﹪(25/35),陰道分泌物slgA抗體陽性率分別為54.6﹪(24/44)和28.6﹪(10/35);hPV1

13、1 E7血清IgG抗體陽性率為68.2﹪(30/44)和97.1﹪(34/35),陰道分泌物slgA抗體陽性率為20.5﹪(9/44)和48.6﹪(17/35).HPV6和HPV11 DNA與HPVl6 DNA陽性患者抗體陽性率差異均有顯著性(P<0.01). 結論： 1.成功構建重組原核表達質粒pET32a(+)/HPV6b E7和pET32a(+)/HPV11E7:并在原核細胞表達系統(tǒng)內成功表達融合蛋白. 2