蘭州地區(qū)人乳頭瘤病毒16型E6、E7基因的克隆及表達(dá).pdf

1、背景與目的：
　　 人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種為無包膜的小型雙鏈環(huán)狀DNA病毒，目前已鑒定有118型，而其中有約40型可感染生殖道粘膜。根據(jù)HPV感染后誘發(fā)病變的良惡性不同進(jìn)一步分為高危型和低危型兩大類，90％以上的宮頸癌組織中可檢測(cè)到高危型HPV16,18,31等型的DNA[1]，以HPV16型為主。HPV16型E6、E7基因在HPV16感染相關(guān)的宮頸癌及54％以上中重度宮頸上皮內(nèi)瘤

2、變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)中持續(xù)性表達(dá)，因此HPV16型E6、E7蛋白與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，而E6、E7蛋白被認(rèn)為是用于免疫治療的首選蛋白。本研究主要進(jìn)行HPV16型E6、E7基因的克隆，并在體外誘導(dǎo)表達(dá)E6、E7蛋白，為今后的蛋白疫苗的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、進(jìn)一步探索HPV16型E6、E7蛋白致宮頸癌分子機(jī)制及宮頸癌及癌前病變的免疫治療奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 1

3、.用PCR法從宮頸癌組織中擴(kuò)增HPV16型E6、E7基因；
　　 2.將HPV16型E6、E7基因片段與克隆載體pMD19-TSimplevector連接，構(gòu)建HPV16型E6、E7的克隆質(zhì)粒pMD19-T-E6，pMD19-T-E7；
　　 3.用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ將HPV16型E6、E7基因從克隆質(zhì)粒pMD19-T-E6，pMD19-T-E7切下，用T4連接酶與表達(dá)載體pET28a(+)連接，構(gòu)建HP

4、V16型E6、E7的表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-E6、pET28a(+)-E7；
　　 4.將表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-E6、pET28a(+)-E7轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中，誘導(dǎo)HPV16型E6、E7蛋白表達(dá)，運(yùn)用SDS-PAGE蛋白電泳檢測(cè)HPV16E6、E7蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1.以宮頸癌組織標(biāo)本中提取的DNA作為模板，PCR擴(kuò)增反應(yīng)之后，得到了大小分別約為490bp、310bp的基因片段；

5、
　　 2.將重組的克隆質(zhì)粒pMD19-T-E6，pMD19-T-E7和表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-E6、pET28a(+)-E7測(cè)序，測(cè)序結(jié)果均顯示E6基因的253位堿基C253AT突變?yōu)門253AT，編碼氨基酸由組氨酸突變成酪氨酸，E7基因測(cè)序結(jié)果與HPV16型E7序列完全一致；
　　 3.構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒pET28a(+)-E6、pET28a(+)-E7可在大腸桿菌BL21中穩(wěn)定表達(dá)HPV16型E6、E7蛋白。