E6-GST融合蛋白表達(dá)及HPV16 E6單克隆抗體制備.pdf

1、人乳頭瘤病毒(HPV Human papillomavirus)是一組具有組織特異性的雙鏈DNA病毒。研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必要因素，特別是HPVl6型在宮頸癌組織中檢出率可高達(dá)50％。HPV感染性疾病、宮頸癌已嚴(yán)重威脅了廣大婦女的生殖健康，現(xiàn)今條件下仍無特效的預(yù)防和治療方法。 乳頭瘤病毒基因組至少有10個(gè)開放閱讀框架(Open reading fame，ORF)，主要位于同一條DNA鏈上，而另一條DNA鏈

2、僅含少量的ORFs，被認(rèn)為是非編碼性的DNA鏈。各種HPV基因結(jié)構(gòu)大致相似，由早期(E)編碼區(qū)、晚期(L)編碼區(qū)以及介于E6和L1之間0.4 kb-1.01 kb的非編碼區(qū)3個(gè)部分組成。 本研究根據(jù)已發(fā)表的HPV16全基因組序列，設(shè)計(jì)并合成一對針對HPVl6E6/7基因序列的特異性引物，以含HPV16E6/7蛋白基因的轉(zhuǎn)基因小鼠的癌組織DNA為模板，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增HPV16E6/7基因序列，其大小為780 bp。

3、 將PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pGEM-T-E6/7，經(jīng)EcoRI和XhoI限制性內(nèi)切酶雙酶切，回收目的片段，并克隆到PGEX-6P-1表達(dá)載體。通過PCR、酶切及測序鑒定證實(shí)，HPVl6E6/7基因以正確的閱讀框架插入到PGEX-6P-1載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，運(yùn)用SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物，并用Western Blot進(jìn)行鑒定，HPVl6E6重組蛋白的

4、相對分子質(zhì)量約為4.3×104。利用親和層析法從表達(dá)產(chǎn)物中純化出目的蛋白。 以純化的HPVl6E6重組蛋白為免疫原免疫BALB/e小鼠，運(yùn)用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞融合，并采用間接ELISA法進(jìn)行篩選，共獲得了4株能穩(wěn)定分泌針對HPVl6E6蛋白的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為4B11ElE8D4、5C2A4D6E8、4B12C5C8F7、2E3F9C4C6，抗體亞型檢測結(jié)果分別為IgG1、IgG2b、IgG1及IgG2