HPV11-E6-E7與人IFNα-2b融合基因表達質粒的構建、表達與實驗免疫研究.pdf

1、人類乳頭瘤病毒(humanpapillomavirus,HPV)可在人類引起多種良惡性疾患，根據(jù)其是否誘發(fā)惡性增生性病變分為低危型和高危型。HPV6、11為低危型，為引起尖銳濕疣(condylomaaccuminatum，CA)的主要HPV型別。CA在全世界發(fā)病率逐年增高，成為性傳播疾病(STD)中的最常見疾病之一。在我國，CA發(fā)病人數(shù)居STD的第二位，在歐美，則已躍居第一位，嚴重威脅著人們的身心健康。CA目前尚沒有特效治療方法，多以去

2、除疣體為主，但治療后復發(fā)率高達90﹪以上，這已成為臨床治療中棘手的問題。 由于目前的常規(guī)手段均不能徹底治愈CA，人們開始將目光集中在HPV疫苗的研制上。然而迄今為止，HPV尚無動物模型，無法進行體外病毒培養(yǎng)，因此按常規(guī)方法研制HPV疫苗非常困難。隨著分子生物學及基因工程的發(fā)展，人們開始運用基因克隆的方法研制DNA疫苗、蛋白疫苗和DC(dendriticcell，樹突狀細胞)疫苗等，其中DNA疫苗由于具有以下優(yōu)點而受到人們的青睞：

3、(1)DNA疫苗免疫應答持久、免疫效果可靠；(2)DNA疫苗可同時誘導體液免疫和細胞免疫；(3)DNA疫苗安全可靠，DNA疫苗的載體部分無免疫原性，可重復接種，不會像重組疫苗一樣產(chǎn)生針對載體的自身免疫反應；(4)DNA疫苗制備簡單，容易大量生產(chǎn)，有利于控制和保證質量，成本低；(5)DNA疫苗性質穩(wěn)定，便于保存和運輸。 由于DNA疫苗具有其它疫苗無可比擬的諸多優(yōu)點，人們開始探索用HPVDNA疫苗預防和治療HPV相關性疾病的可能。部

4、分型別的HPV疫苗已經(jīng)進入臨床試驗階段，但多集中于高危型，針對引起CA的主要型別HPV6、HPV11則較少。目前HPV疫苗的研制主要集中在L區(qū)和E6、E7區(qū)。HPV衣殼蛋白主要由L1和L2組成。L1序列保守，為HPV主要種特異性抗原，可誘生中和性抗體，主要用于制備預防性疫苗。因此，用L1抗原可制備CA的預防性疫苗及實驗室診斷。E6、E7主要用于制備治療性疫苗，研究表明E6、E7蛋白能夠激發(fā)機體的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應和T輔助細

5、胞(Th)反應，加之DNA疫苗的優(yōu)點和前景，用E6、E7制備DNA疫苗具有可行性。 然而并非所有的DNA疫苗都能誘導出理想的和高水平的免疫反應，這給它的臨床應用帶來了障礙。研究表明CA患者存在著細胞因子失衡所引起的一系列細胞免疫抑制現(xiàn)象，因此改善和提高HPV感染者的細胞免疫功能成為HPV疫苗尤其是HPVDNA疫苗研究的目標之一。有研究表明細胞因子基因與目的基因共表達或共接種可以提高目的基因編碼抗原誘導的免疫反應，鑒于此，我們選擇

6、人IFNα-2b與HPV11-E6/E7的編碼基因構建共表達質粒探討人IFNα-2b在改善和提高HPVDNA疫苗方面的作用。IFNα具有以下作用：(1)IFNα在Th1的分化中起著重要的作用；(2)IFNα具有促進NK細胞、巨噬細胞增殖的作用，可誘導其產(chǎn)生IFN和IL-1；(3)IFNα可促進樹突狀細胞的成熟并增強其活性；(4)IFNα亦可促進B細胞的增殖、分化，免疫球蛋白的分泌以及Ig重鏈的轉化?？傊?，鑒于CA的高發(fā)病率和高復發(fā)率，且

7、目前尚沒有特效治療方法，以及HPVDNA疫苗在治療CA中的前景和IFNα-2b在免疫反應中的作用，本研究選擇引起CA的主要型別HPV11-E6/E7作為研究對象，利用IFNα-2b作為細胞因子基因與目的基因共表達或共接種可以提高目的基因編碼抗原誘導的免疫反應這一構思，首次通過連接肽基因將HPV¨-E6/E7與IFNα-2b連接后構建共表達質粒(到目前為止，國內外尚無研究用IFNα-2b與HPV的其它型別構建共表達質粒)，在原核及真核細胞

8、中表達，并進行動物免疫接種實驗，以探討IFNα-2b在改善和提高HPV11DNA疫苗免疫效果方面的作用。 研究目的第一部分構建HPV11-E6/E7與人IFNα-2b融合基因表達載體，并在E.coliBL21進行原核表達。第二部分構建HPV11-E7及人IFNα-2b的真核表達載體，并在CHO細胞中進行真核表達。第三部分將pcDNA3.1(+)-HPV11-E7、pcDNA3.1(+)-IFNα-2b-linker-HPV11-

9、E7作為免疫原免疫小鼠，觀察小鼠的免疫功能狀態(tài)和細胞免疫應答。 研究方法第一部分：通過連接肽基因將HPV11-E6/E7與人IFNα-2b編碼基因連接并克隆入原核表達載體pET-32a，進行酶切鑒定及DNA序列分析；將重組質粒轉染E.coliBL21，經(jīng)IPTG誘導后對其表達產(chǎn)物進行SDS-PAGE和WesternBlotting分析。第二部分：同時用KpnⅠ、EcoRⅠ酶切pET-32a-IFNα-2b-linker-HPV1

10、1-E7及pcDNA3.1(+)，將酶切產(chǎn)物純化回收，兩者的回收產(chǎn)物進行連接反應，構建pcDNA3.1(+)-IFNα-2b-linker-HPV11-E7，并轉化感受態(tài)細胞大腸桿菌DH5α，隨機挑選陽性克隆并提取質粒酶切鑒定；用脂質體法轉染CHO細胞，用免疫熒光法檢測融合基因的表達。第三部分：構建pcDNA3.1(+)-HPV11-E7；將28只BALB/c小鼠隨機分為4組，每組7只，即PBS組(A組)、空載質粒組即pcDNA3.1組

11、(B組)、pcDNA3.1(+)-HPV11-E7組(C組)、融合基因組即pcDNA3.1(+)-IFNα-2b-linker-HPV11-E7組(D組)。初次免疫后兩周以同樣方法和相同劑量加強免疫，二次免疫后再以同樣方法和相同劑量加強免疫。于六周后剖殺BALB/c小鼠，取脾并分離脾淋巴細胞，進行細胞培養(yǎng)并刺激單個核細胞產(chǎn)生細胞因子，用FCM檢測Th1、Th2細胞因子比例。 研究結果第一部分：測序結果表明成功地將HPV11-E6

12、、E7和人IFNα-2b通過連接肽基因連接并克隆入pET-32a，且其基因序列與設計完全一致；SDS-PAGE結果顯示HPV11-E6與人IFNα-2b融合基因未見表達，SDS-PAGE和WesternBlotting分析結果均顯示HPV11-E7與人IFNα-2b融合基因成功表達，在分子量約50KD位置可見明顯蛋白條帶。第二部分：DNA測序結果顯示，成功將IFNα-2b-linker-HPV11-E7克隆入pcDNA3.1(+)的Kp

13、nⅠ、EcoRⅠ位點之間，且其序列與設計完全一致；免疫熒光顯微鏡觀察可見目的蛋白的表達。第三部分：融合基因組即pcDNA3.1(+)-IFNα-2b-HPV11-E7組的IFN-γ水平明顯高于pcDNA3.1(+)-HPV11-E7組，差異具有顯著性(p＜0.001)；融合基因組與pcDNA3.1(+)-HPV11-E7組的IFN-γ水平明顯高于對照組PBS組及空載質粒pcDNA3.1(+)組，差異具有顯著性(p＜0.001)；兩對照組

14、之間的IFN-γ水平無明顯差異(p＞0.05)。4組之間的IL-4及IL-10水平無明顯差異(p＞0.05)。 結論第一部分：HPV11-E7與人IFNα-2b融合基因表達載體的成功構建及表達，為今后的相關實驗免疫研究奠定了基礎。第二部分：成功地構建了HPV11-E7及IFNα-2b的真核表達載體，并在CHO細胞中表達，為提高DNA疫苗免疫效果的研究奠定了基礎。第三部分：作為細胞因子，IFNα-2b能明顯加強HPV11-E7的免