SRBSDV和RBSDV檢測(cè)技術(shù)的建立.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病是威脅我國(guó)水稻生產(chǎn)的重要病毒病害之一，由南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）引起。該病毒屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）。主要由遷飛性的白背飛虱（Sogatella furcifera）以持久增殖型方式傳播，不經(jīng)卵傳播，白背飛虱一旦獲毒則終身帶毒；灰飛虱（Laodelphax striatellus

2、）也可以帶毒，但不能傳毒。水稻一旦發(fā)生該病即沒(méi)有有效藥物或方法進(jìn)行治療，而且發(fā)病植株將作為侵染源被介體白背飛虱向周圍健康水稻傳播病毒，將加重田間的病害發(fā)生。因此需及時(shí)檢測(cè)田間水稻和介體昆蟲的帶毒情況，盡早拔除發(fā)病植株，滅殺田間介體昆蟲，從而阻斷病害的擴(kuò)散。目前檢測(cè)病毒的方法較多，常用RT-PCR法檢測(cè)SRBSDV，但該方法存在操作復(fù)雜、耗時(shí)、成本高等缺陷，不適用于大批量樣品的檢測(cè)。
　　為了建立快速、簡(jiǎn)便、特異性的病毒檢測(cè)技術(shù)，本

3、研究?jī)?yōu)化了免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增（Immunocapture reverse transcription,IC-RT-PCR）和逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（Reverse transcription loop-mediared isothermal amplification,RT-LAMP）體系，用于檢測(cè)水稻和介體昆蟲中的SRBSDV。通過(guò)對(duì)免疫捕獲抗體的篩選，明確SRBSDV P9-1蛋白的多克隆抗體可用于免疫捕獲反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)，用于捕獲

4、水稻或介體昆蟲中的病毒，從而捕獲病毒RNA，用于RT-PCR檢測(cè)病毒。通過(guò)對(duì)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中Mg2+濃度、dNTP濃度、反應(yīng)溫度以及鈣黃綠素用量的優(yōu)化，建立了適合檢測(cè)SRBS DV的RT-LAMP檢測(cè)方法，并將RT-LAMP方法應(yīng)用于檢測(cè)2013年不同地區(qū)采集到的水稻病樣和介體昆蟲的帶毒率。此外，本研究通過(guò)原核表達(dá)蛋白制備了RBSDV編碼蛋白P9-1的多克隆抗體，Western blot實(shí)驗(yàn)表明所制備的抗體可特異性檢測(cè)RBSDV侵染

5、水稻中的P9-1蛋白，并可通過(guò)IC-RT-PCR方法檢測(cè)RBSDV侵染的褐飛虱。
　　通過(guò)對(duì)檢測(cè)方法的比較，本研究所建立的RT-LAMP較IC-RT-PCR方法靈敏。由于IC-RT-PCR不需要提取RNA，避免了提取單頭昆蟲RNA的困難，因此比較適用于單頭飛虱帶毒檢測(cè)；而RT-LAMP方法可同步進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR，與常規(guī)RT-PCR方法比較縮短了檢測(cè)時(shí)間，因此適用于水稻樣品的快速檢測(cè)。本研究對(duì)RT-LAMP和IC-RT-PCR檢測(cè)