基于NASBA技術檢測細菌耐藥性方法的建立.pdf

1、目的：產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌在世界各地的爆發(fā)威脅著人類的生命健康，而且攜帶KPC的細菌感染與高死亡率呈正相關。因此及時準確快速的檢出產(chǎn) KPC細菌對預防、控制耐藥菌株的流行意義重大。推薦的改良Hodge試驗準確性高，但較費時。PCR擴增檢測時間大大縮短，但對儀器設備和場所要求較高。核酸序列依賴性擴增NASBA具有操作簡便、擴增效率高、特異性強的優(yōu)點。本研究旨在建立檢測KPC耐藥的NASBA檢測方法，并對該方法進行初步評價。
　

2、　方法：本實驗采用依賴KPC轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA的NASBA擴增檢測KPC耐藥。根據(jù)Genebank中肺炎克雷伯菌管家基因MDH的保守序列、腸桿菌科細菌耐藥基因KPC的保守序列設計NASBA引物，將上述擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳及測序鑒定。同時摸索及優(yōu)化NASBA反應中各酶濃度、離子濃度、反應溫度等條件，分析該方法的靈敏度和特異性。采用該NASBA方法、PCR及逆轉(zhuǎn)錄PCR檢測臨床收集的45株肺炎克雷伯菌，比較結果的一致性。
　　結果

3、：KPC及MDH的NASBA擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分別得到249 n t、190nt的特異性條帶，并且測序鑒定序列與預計片段序列比對一致。通過摸索及優(yōu)化NASBA反應中各酶濃度、離子濃度、反應溫度等條件建立NASBA擴增體系（24μl）：緩沖液中氯化鉀終濃度60mmol/L，氯化鎂終濃度14mmol/L，PH8.0 Tris-HCl終濃度40mmol/L，DTT終濃度7.5mmol/L，DMSO終濃度15％；每個引物終濃度0.2μm

4、ol/L；d N T P1mmol/L；N T P2mmol/L；酶混合液中T7 R N A聚合酶50 U、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶10U、RNase H0.5U、BSA0.1mg/ml；反應溫度：40℃；反應時間：90min。該NASBA方法能檢測到10-3ng/μl的RNA量，較RT-PCR方法多2個數(shù)量級，提示該方法比RT-PCR靈敏度高；對照KPC陰性菌株與KPC陽性菌株的NASBA擴增產(chǎn)物電泳分析發(fā)現(xiàn)僅KPC陽性菌株出現(xiàn)特異性條帶。45