鼠疫F1抗原的磁粉球-ELISA和免疫-PCR檢測(cè)技術(shù)的建立.pdf

1、鼠疫(plague)是鼠疫耶爾森氏菌引起的以跳蚤為媒介的在溫血?jiǎng)游镉绕涫菄X類(lèi)動(dòng)物間流行的自然疫源性疾病，同時(shí)也是危害嚴(yán)重的人獸共患病。在世界范圍內(nèi)均有其疫源地分布。歷史上曾3次出現(xiàn)鼠疫大流行，死亡人數(shù)數(shù)以千萬(wàn)計(jì)。目前其流行呈現(xiàn)以下特點(diǎn)：流行范圍有所擴(kuò)大，疫情有上升趨勢(shì)；某些疫區(qū)間隔多年后又出現(xiàn)小面積暴發(fā)；疫區(qū)有向城市和人口密集區(qū)蔓延的趨勢(shì)；主要宿主數(shù)量明顯回升，某些地區(qū)動(dòng)物鼠疫重新發(fā)生。在我國(guó)，1978～1997年共有云南、西藏、青海

2、、甘肅、新疆、內(nèi)蒙古六省發(fā)生人間鼠疫456例，死亡105例，病死率達(dá)23.03％；其中1978～1987年發(fā)生106例，1988～1997年發(fā)生350例，后10年是前10年的3.3倍，呈明顯上升趨勢(shì)；發(fā)病地區(qū)主要是旱獺疫源地和黃胸鼠疫源地?！笆濉逼陂g，共有7省(區(qū))43縣發(fā)生人間鼠疫206例，14省(區(qū))278縣次發(fā)生動(dòng)物鼠疫疫情，其中13個(gè)為新增鼠疫疫源縣。因此對(duì)鼠疫快速準(zhǔn)確的診斷顯得尤為重要。傳統(tǒng)的顯微鏡觀察、培養(yǎng)、噬菌體裂解和動(dòng)

3、物實(shí)驗(yàn)4步檢測(cè)法，耗時(shí)較長(zhǎng)，步驟繁瑣，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查需要。隨著免疫學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)鼠疫各種特異性抗原、毒力因子及其抗體的新的診斷方法不斷涌現(xiàn)，如間接血凝法(Indirect hemagglutination assay,IHA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme LinkedImmunosorbcnt Assay,ELISA)、斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(DOT-ELISA)、放射免疫沉淀法(Radioimmuno Precipi

4、tation Test，RIP)等。許多蛋白和因子被選為這些診斷方法的標(biāo)靶，如pgm、pst、Yops、F1抗原、V抗原等。其中F1抗原是鼠疫菌的特異性抗原，也是被證實(shí)的保護(hù)性抗原。鼠疫菌F1抗原是存在于鼠疫菌體表面的莢膜物質(zhì)，由分子量為61-65MD的質(zhì)粒編碼，在37℃培養(yǎng)時(shí)可以產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)表明，從大腸桿菌重組株中純化的F1抗原能保護(hù)小鼠對(duì)抗經(jīng)皮下或吸入途徑的強(qiáng)毒菌的攻擊，因此針對(duì)F1抗原或抗體的檢測(cè)成為鼠疫診斷方法研究的熱點(diǎn)。

5、 趙旭東等根據(jù)某些高分子化學(xué)物質(zhì)的聚合性質(zhì)，結(jié)合免疫親和層析和磁學(xué)原理研制出磁粉球。通過(guò)使用抗原(或抗體)對(duì)磁粉球致敏，即可應(yīng)用于其對(duì)應(yīng)的抗體(或抗原)的篩選和純化，從而實(shí)現(xiàn)液體介質(zhì)中某些抗原或抗體的富集，提高檢測(cè)的陽(yáng)性率。國(guó)外一些文獻(xiàn)報(bào)道應(yīng)用磁性吸附顆?？梢詫?shí)現(xiàn)對(duì)某些蛋白、細(xì)胞因子甚至核酸的分離和純化。目前，國(guó)內(nèi)也有個(gè)別學(xué)者嘗試應(yīng)用國(guó)外磁珠產(chǎn)品分離、檢驗(yàn)?zāi)[瘤細(xì)胞，但磁粉球的自主生產(chǎn)及應(yīng)用于純化和檢測(cè)抗原(或抗體)的研究國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。

6、 免疫-PCR(immuno polymerase chain reaction，I-PCR)是1992年Sano T等建立的一種微量抗原檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)的基本原理是將一段生物素標(biāo)記的已知序列的DNA分子特異性的連接到抗原一單克隆抗體復(fù)合物上，PCR擴(kuò)增該DNA片段，通過(guò)電泳定性分析，根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無(wú)來(lái)判斷待測(cè)抗原是否存在。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起來(lái)，其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段

7、DNA報(bào)告分子代替酶反應(yīng)來(lái)放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA。由于該方法同時(shí)具備免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)的高特異性和分子生物學(xué)PCR技術(shù)的強(qiáng)大擴(kuò)增能力，必將在疾病的診斷，特別是極微量抗原檢測(cè)中發(fā)揮巨大的作用。目前，將免疫-PCR應(yīng)用于鼠疫檢測(cè)的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。 本研究擬通過(guò)制備磁粉球及抗鼠疫F1單克隆抗體(McAb)，創(chuàng)建針對(duì)鼠疫F1抗原的磁粉球-ELISA和免疫-PCR檢測(cè)方法；并通過(guò)對(duì)鼠疫F1抗原檢測(cè)，就其敏感性、穩(wěn)定性、實(shí)

8、用性和操作的簡(jiǎn)便情況與夾心-ELISA、生物素-ELISA(ABC-ELISA)進(jìn)行綜合比較，以確定這兩種檢測(cè)方法在臨床和流行病學(xué)調(diào)查中應(yīng)用的可行性，以期找到一種簡(jiǎn)潔、高效、準(zhǔn)確率高的血清學(xué)診斷方法，并對(duì)其應(yīng)用前景進(jìn)行初步評(píng)價(jià)。 方法: 采用聚合法研制磁粉球，將磁粉、苯乙烯、甲苯、反丁烯二酸、對(duì)二甲苯攪拌混勻后，置分散液中，在催化劑作用下，于80～90℃溫度下高速攪拌、洗滌、分離，于-20℃、-5℃和4℃存放條件下觀察磁

9、粉球放置1～6個(gè)月的理化穩(wěn)定性。 將鼠疫F1抗原加入含碳二亞胺的磁粉球PBS混合液，4℃放置48h形成致敏磁粉球。將待提純鼠疫抗體加入致敏磁粉球中，37℃搖床振搖1h，洗滌，pH2.5～2.8甘氨酸鹽酸解離透析。 常規(guī)方法制備抗鼠疫F1抗原特異McAb，應(yīng)用磁粉球進(jìn)行純化，間接ELISA法檢測(cè)其抗體滴度，布魯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O<,3>、O<,9>、傷寒桿菌、霍亂弧菌、痢疾桿菌、出血大腸桿菌、致病大腸桿菌抗原作包

10、被抗原檢測(cè)其特異性。采用棋盤(pán)滴定法，確定最佳多抗包被濃度、單抗和親合素稀釋濃度，應(yīng)用常規(guī)夾心ELISA和ABC-ELISA法，檢測(cè)不同濃度的鼠疫F1抗原。 磁粉球-ELISA檢測(cè)方法為：將抗鼠疫F1抗原McAb致敏的磁粉球加入含鼠疫F1抗原待測(cè)樣本的Ep管內(nèi)，37℃輕度渦式搖動(dòng)40min，以后各步驟與常規(guī)ELISA基本相同，不同點(diǎn)為各步驟均要輕度渦式搖動(dòng)，且需應(yīng)用磁鐵吸附磁粉球結(jié)合PBS-T<,20>進(jìn)行洗滌。將其敏感度、穩(wěn)定性

11、與上述3種實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行對(duì)比。 以生物素標(biāo)記M13-20(Bio-5’-GTAAAACGGCCAGT-3’)為上游引物，無(wú)生物素標(biāo)記M13(5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’)為下游引物，構(gòu)建生物素標(biāo)記DNA探針，目的片段長(zhǎng)度為227bp，I-PCR法檢測(cè)鼠疫菌不同濃度的F1抗原。 結(jié)果: 研制出的磁粉球是直徑為0.5～2.0μm的球狀體，比重1.07～1.15， -5℃和4℃條件下存放6個(gè)月，加入

12、硫酸后質(zhì)量分別減少10％和6％； 經(jīng)F1抗原致敏后純化抗鼠疫F1 McAb的量最高達(dá)1.9mg/g；F1抗原致敏的磁粉球-5℃和4℃存放6個(gè)月后，純化抗體量分別減少5.3％和26％； 制備的抗鼠疫F1 McAb，為IgG1亞型，滴度為1：1×10<'6>，與布魯氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌O3、O9等無(wú)交叉反應(yīng)； 夾心-ELISA的最適多抗稀釋比例為1：1000，單抗稀釋比例為1：2000，可檢測(cè)到的最低鼠疫F1抗

13、原濃度為0.032μg/ml，平行對(duì)照OD值差異<0.034，重復(fù)3次，檢測(cè)到的最低抗原濃度不變； ABC-ELISA的最適親合素濃度為1μg/ml，可檢測(cè)到的最低鼠疫抗原濃度為0.004μg/ml，平行對(duì)照OD值差異<0.063，重復(fù)3次，檢測(cè)到的最低抗原濃度不變； 磁粉球．ELISA檢測(cè)到的最低抗原濃度為0.002μg/ml，平行對(duì)照OD值差異<0.031，重復(fù)3次，檢測(cè)到的最低抗原濃度不變； I-PCR的最

14、適親合素濃度和生物素標(biāo)記DNA探針濃度為10ng/ml和10pg/ml，可檢測(cè)到最低鼠疫F1抗原濃度可達(dá)5pg/ml，5次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，2次有假陽(yáng)性條帶出現(xiàn)； 結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)研制的磁粉球在抗原、抗體的純化和疾病的免疫學(xué)診斷方面，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景；所制備的抗鼠疫F1抗原McAb通過(guò)致敏磁粉球純化后，純度高、特異性強(qiáng)； 所建立的磁粉球-ELISA法檢測(cè)樣本量大、穩(wěn)定性好、靈敏度高，與夾心．ELISA和ABC-ELISA相比，