雙抗體夾心ABC--ELISA和膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)弓形蟲循環(huán)抗原方法的建立.pdf

1、弓形蟲是一種專性細(xì)胞內(nèi)寄生的寄生蟲，宿主范圍廣泛，可寄生于哺乳動(dòng)物、鳥類及一些冷血?jiǎng)游?，呈世界范圍?nèi)流行，全球約有10億人感染，我國(guó)人群感染率為7.88％。畜禽血清陽(yáng)性率很高，豬弓形蟲陽(yáng)性率高達(dá)30.16％，弓形蟲感染嚴(yán)重影響了人的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展。弓形蟲是一種機(jī)會(huì)致病原蟲，人感染后多數(shù)無明顯特異性癥狀表現(xiàn)，但急性感染發(fā)生于孕婦、初生兒或免疫抑制患者就會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的后果，因此對(duì)弓形蟲病的早期診斷和盡早治療具有重要意義。弓形蟲循環(huán)抗原(c

2、irculating antigen，CAg)是弓形蟲感染過程中出現(xiàn)最早的特異性標(biāo)志物，通過檢測(cè)血清弓形蟲循環(huán)抗原可以實(shí)現(xiàn)對(duì)弓形蟲急性感染的早期或活動(dòng)期的檢測(cè)，本研究建立了雙抗體夾心ABC-ELISA和膠體金免疫層析試紙條兩種方法，來檢測(cè)弓形蟲循環(huán)抗原，以實(shí)現(xiàn)弓形蟲感染的早期診斷，對(duì)目前通過抗體檢測(cè)弓形蟲的方法是一種有效的補(bǔ)充。
　　試驗(yàn)1抗CAg單抗的制備及抗ESA多抗的制備
　　弓形蟲循環(huán)抗原(CAg)是弓形蟲早期感染的

3、重要指標(biāo)，制備抗CAg的高特異性抗體，對(duì)于建立弓形蟲感染的早期診斷方法具有重要意義。制備了弓形蟲排泄分泌抗原（excretory-secretory antigens，ESA），并將其免疫動(dòng)物，融合后的雜交瘤細(xì)胞先通過兩種ESA抗原的篩選，再經(jīng)含CAg的陽(yáng)性血清篩選，以獲得特異性針對(duì)CAg的單抗，并對(duì)所獲單抗的性質(zhì)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，獲得了3A5、3E5和10F5-3三株單抗，其效價(jià)分別為1∶64000、1∶32000、1∶32000，

4、三株單抗分別針對(duì)不同的抗原表位，免疫熒光定位顯示三株抗體均與弓形蟲反應(yīng)，表明獲得的三株單抗對(duì)弓形蟲CAg都有較高的特異性，均可應(yīng)用于對(duì)弓形蟲感染早期或活動(dòng)期的診斷。
　　試驗(yàn)2雙抗夾心ABC-ELISA方法的建立
　　為檢測(cè)弓形蟲循環(huán)抗原，以實(shí)現(xiàn)弓形蟲急性感染的早期診斷，建立了基于ABC(avidin biotin-peroxidase complex)放大系統(tǒng)的雙抗體夾心ELISA方法。以方陣滴定法確定多抗最佳包被量和單抗

5、工作濃度，利用夾心法和ABC放大系統(tǒng)建立了檢測(cè)弓形蟲循環(huán)抗原的夾心ABC-ELISA方法，用該方法對(duì)人工感染犬和陽(yáng)性感染血清進(jìn)行檢測(cè)以確定該方法的檢出時(shí)間和準(zhǔn)確性，并應(yīng)用于臨床樣本的檢測(cè)。結(jié)果表明，雙抗體夾心ELISA反應(yīng)條件:兔多抗包被濃度為3.7μg/mL，生物素標(biāo)記3A5、3E5和10F5-3單抗在混合工作液中的濃度分別為0.1μg/mL、0.13μg/mL、0.12μg/mL，酶標(biāo)生物素和鏈酶親和素以2∶3體積比混合成ABC復(fù)合

6、物。該ELISA方法的對(duì)ESA最低檢測(cè)限為11.9 ng/mL，并與隱孢子蟲早期感染牛血清、血吸蟲尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球蟲早期感染雞血清、犬瘟熱急性感染早期血清、犬細(xì)小急性感染血清無交叉反應(yīng)。用該ELISA方法檢測(cè)人工感染的犬，于感染后2d血清即顯示陽(yáng)性，本方法能明顯區(qū)分標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清和陰性血清。68份豬臨床血樣（混入2份標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清）用該方法和Nest PCR同時(shí)檢測(cè)結(jié)果一致。表明該雙抗體夾心ABC-ELISA方法特異性強(qiáng)、靈敏性

7、高，可用于弓形蟲急性感染的早期、或活動(dòng)期的快速診斷。
　　試驗(yàn)3膠體盒免疫層析試紙條的研制
　　為建立一種簡(jiǎn)易、快速的膠體金免疫層析法(colloidal gold immunochromatography test，ICT)用于檢測(cè)血清中弓形蟲循環(huán)抗原(CAg)。采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，用膠體金顆粒標(biāo)記抗CAg單克隆抗體，抗ESA兔多抗噴涂于NC膜，建立了基于雙抗夾心法的免疫層析檢測(cè)方法，血清中的弓形蟲循環(huán)抗原

8、與金標(biāo)記單克隆抗體結(jié)合后沿著硝酸纖維素膜移動(dòng)，與膜上的固相多克隆抗體結(jié)合形成肉眼可見的紅色線條。用該方法對(duì)感染后不同時(shí)間犬陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)已知弓形蟲感染陰性和陽(yáng)性血清進(jìn)行檢測(cè)以確定其準(zhǔn)確性，與雙抗體夾心ABC-ELISA進(jìn)行比較。結(jié)果表明，使用該試紙條檢測(cè)弓形蟲感染犬血清，感染后2～7 d的血清均為陽(yáng)性，表明該方法適用于弓形蟲感染的早期診斷，并與隱孢子蟲早期感染牛血清、血吸蟲尾蚴早期感染牛血清、艾美耳球蟲早期感染雞血清、犬瘟熱急性