基于IgY的免疫磁珠夾心ELISA法檢測日本血吸蟲循環(huán)抗原的研究.pdf

1、血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人類健康并阻礙疫區(qū)社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展的人畜共患病，目前全球約有7.79億人受威脅，感染者達(dá)2.07億人。我國日本血吸蟲病主要分布于長江流域及其以南的12個(gè)省市自治區(qū)，至2006年底仍有日本血吸蟲病人67.13萬。血吸蟲病仍然是我國乃至世界范圍內(nèi)的嚴(yán)重危害人類健康的公共衛(wèi)生問題之一。因此，我國血防工作所面臨的形勢仍然十分嚴(yán)峻。
　　 由于吡喹酮仍然是殺滅血吸蟲的有效藥物，因此診斷在血吸蟲病防治中處于重要位置。早期正

2、確的診斷和及時(shí)有效的治療是防止慢性和晚期血吸蟲病發(fā)生的關(guān)鍵。目前血吸蟲病診斷主要依靠糞檢發(fā)現(xiàn)蟲卵或血清學(xué)試驗(yàn)檢測特異性抗體，但由于糞檢易受感染度和感染時(shí)間的影響，且工作量大、受檢者的依從性差，因此單純依靠糞檢診斷血吸蟲病已不能適應(yīng)血防工作的需要。隨著免疫學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外逐漸利用檢測人群血清中特異性抗體的方法來彌補(bǔ)糞檢方法的不足。檢測血清中特異性抗體的方法具有方法簡便、快速和人群依從性較好的優(yōu)點(diǎn)，但由于血吸蟲特異性抗體能在感染者體內(nèi)存

3、在很長時(shí)間，甚至在治愈后數(shù)年仍可從血清中測出，因此此法不能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染，也無考核療效的價(jià)值。為了克服抗體檢測技術(shù)的不足，從上世紀(jì)80年代開始，人們轉(zhuǎn)而研究檢測血吸蟲循環(huán)抗原的技術(shù)。由于循環(huán)抗原是由活蟲排放的，蟲體死亡后患者體內(nèi)的循環(huán)抗原也會很快消失，因此檢測血吸蟲循環(huán)抗原的優(yōu)點(diǎn)在于它能區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染，且具有考核療效的價(jià)值。已報(bào)道的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法有間接紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、時(shí)間分辨免疫熒光分析方法、磁珠抗原捕獲酶聯(lián)免

4、疫試驗(yàn)、雜交瘤細(xì)胞凝集試驗(yàn)、試紙條法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，但迄今為止，尚無敏感性高、特異性強(qiáng)的檢測循環(huán)抗原的技術(shù)問世，至此，血吸蟲病的免疫診斷成為制約血吸蟲病防治工作發(fā)展的瓶頸問題。利用免疫學(xué)的新技術(shù)和新方法，開發(fā)具有敏感性高、特異性強(qiáng)、適于現(xiàn)場應(yīng)用的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的新技術(shù)，以適應(yīng)新形式下血防工作的需要是當(dāng)前亟待解決的問題。
　　 IgY是雞的卵黃免疫球蛋白的簡稱（Immunoglobulin of egg yolk，IgY

5、），通過皮下注射特異性抗原，雞可產(chǎn)生相應(yīng)的特異性抗體并可從母雞的血清傳遞到蛋黃中。這種從蛋黃中提取的抗體稱為IgY。由于IgY可與抗原上的更多表位發(fā)生反應(yīng)，起到信號放大作用，因此可提高免疫學(xué)診斷的敏感性。Ohnishi等發(fā)現(xiàn)，IgY可使ELISA檢測的靈敏度提高10倍。此外，IgY不與補(bǔ)體系統(tǒng)、類風(fēng)濕因子、哺乳動物抗體以及人或細(xì)菌Fc 受體等結(jié)合，因此可減少免疫檢測中哺乳動物血清樣本中無關(guān)因子的干擾從而避免假陽性或假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。Ig

6、Y的獨(dú)特優(yōu)勢使其被歐洲實(shí)驗(yàn)方法替換確認(rèn)中心（European Centre for the Validation of Alternative Method，ECVAM）推薦為哺乳動物IgG的替代免疫球蛋白，并被應(yīng)用于多種疾病的免疫診斷中。但迄今為止，尚未見到將其應(yīng)用于血吸蟲病免疫學(xué)診斷的報(bào)道。
　　 免疫磁珠酶聯(lián)免疫法（Immunomagnetic bead ELISA，IMB-ELISA）是20世紀(jì)80年代末發(fā)明的一種新的檢

7、測技術(shù)，該技術(shù)以高均一的納米磁性微球?yàn)楣滔嘀С治铮捎诩{米磁珠顆粒小、表面積大，可結(jié)合更多的診斷分子，因此可提高Ig分子的Fab與抗原結(jié)合的機(jī)會，使蛋白吸附能力超出酶標(biāo)板載體的1000倍以上，克服了普通酶標(biāo)板酶聯(lián)免疫技術(shù)的缺點(diǎn)。
　　 本課題結(jié)合上述兩項(xiàng)新技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，制備了抗日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原(Soluble egg antigen，SEA)的IgY（anti-SEA IgY），并將anti-SEA IgY耦聯(lián)在納米磁珠上

8、，建立了基于IgY的免疫磁珠夾心ELISA法（Immunomagnetic bead ELISA based on IgY，IgY-IMB-ELISA）。用IgY-IMB-ELISA法檢測血吸蟲感染小鼠血清和尿液中的循環(huán)可溶性蟲卵抗原（Circulating soluble egg antigen，CSEA），并將其用于檢測血吸蟲病患者血清中CSEA，從而為檢測日本血吸蟲循環(huán)抗原提供一種新的技術(shù)。
　　 本課題分為以下四個(gè)部分：

9、
　　 一、IgY-IMB-ELISA法的建立
　　 本實(shí)驗(yàn)用日本血吸蟲SEA免疫萊杭母雞，用EGGstract IgY Purification System提取和純化了anti-SEA IgY，并對其進(jìn)行了SDS-PAGE和Western-blotting鑒定，成功制備了分子量為130 kDa的特異性IgY多克隆抗體。該多克隆抗體可特異性地識別日本血吸蟲SEA中140 kDa、100 kDa和69 kDa三種抗原成分

10、。將IgY與免疫磁珠偶聯(lián)并將其作為捕獲抗體，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的小鼠抗SEA單克隆抗體NP28-5B（NP28-5B labeled horseradish peroxidase，HRP-NP28-5B）作為檢測抗體，建立了IgY-IMB-ELISA法，此法最低可檢測出5ng/ml的SEA。
　　 二、IgY-IMB-ELISA法檢測日本血吸蟲感染小鼠血清中循環(huán)抗原的研究
　　 用IgY-IMB-ELISA法檢測日本血

11、吸蟲不同感染度的小鼠血清中CSEA的動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，重度感染組（30只尾蚴/每鼠）和輕度感染組（10只尾蚴/每鼠）小鼠血清中CSEA分別在感染后4周和5周出現(xiàn)陽性，之后血清中CSEA水平迅速升高，至感染后第8周到達(dá)高峰，然后維持至少6周的平臺期，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束（感染后14周）。研究結(jié)果表明宿主體內(nèi)的CSEA水平與感染度呈正相關(guān)。
　　 此外，本研究觀察了吡喹酮治療對重度感染組小鼠血清中CSEA的影響。感染小鼠血清中CSEA水平

12、在吡喹酮治療后6周降至陰性對照組水平，說明本研究所建立的檢測方法可用于評估化療的效果。
　　 三、IgY-IMB-ELISA法檢測日本血吸蟲病患者血清中循環(huán)抗原的研究
　　 本研究在利用IgY-IMB-ELISA法成功檢測出動物血清中CSEA的基礎(chǔ)上，進(jìn)而將其用于檢測血吸蟲病患者血清中的CSEA。研究發(fā)現(xiàn)，IgY-IMB-ELISA法對急性和慢性血吸蟲病患者的檢出率分別是100%（40/40）和91.5%（107/117

13、）。與正常人血清未出現(xiàn)陽性反應(yīng)（0/49）。與肺吸蟲病人血清無交叉反應(yīng)（0/20），與肝吸蟲病人的交叉反應(yīng)為3.3%（1/30）。IgY-IMB-ELISA法檢測血吸蟲病的特異性為99.0%，該法檢測急性和慢性血吸蟲病的約登指數(shù)分別為0.99和0.91。說明IgY-IMB-ELISA法是一種敏感性和特異性均較高的檢測血吸蟲循環(huán)抗原的方法。
　　 四、IgY-IMB-ELISA法檢測日本吸蟲感染小鼠尿液中循環(huán)抗原的研究
　　

14、 本研究用IgY-IMB-ELISA法檢測血吸蟲感染小鼠尿液中CSEA并觀察其動態(tài)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重度和輕度感染組分別于感染后8周和10周尿液中CSEA水平達(dá)到高峰，之后一直維持平臺期直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。在感染后8周至14周中，重度感染組小鼠尿液中CSEA水平明顯高于輕度感染組。
　　 重度感染組小鼠在吡喹酮治療4周后尿液中CSEA水平明顯升高，然后下降，治療后8周降至陰性對照組的水平。與同期血清中CSEA水平相比，尿液中CSEA出現(xiàn)

15、的時(shí)間較晚、水平較低。尿液中CSEA水平受吡喹酮治療影響明顯滯后于其對血清中CSEA水平的影響，這可能與腎臟對循環(huán)抗原的濃縮和延遲排出作用有關(guān)。
　　 本研究探討了血吸蟲感染小鼠尿液中CSEA的動態(tài)變化及吡喹酮化療對其的影響，為下一步檢測血吸蟲病患者尿液循環(huán)抗原奠定了良好的基礎(chǔ)。
　　 綜上所述，本課題研究結(jié)果為：
　　 1.首次成功地制備了分子量為130 kDa的抗SEA的特異性IgY多克隆抗體，該抗體可特異性

16、地識別日本血吸蟲SEA中140 kDa、100 kDa和69 kDa三種抗原成分。
　　 2.結(jié)合IgY和IMB-ELISA的優(yōu)點(diǎn)，首次建立了IgY-IMB-ELISA法，該法可檢出低至5ng/ml的SEA。
　　 3.利用IgY-IMB-ELISA法檢測不同感染度小鼠血清和尿液中的CSEA，初步闡明了CSEA在感染小鼠血清和尿液中的動態(tài)變化規(guī)律，為血吸蟲循環(huán)抗原的適宜檢測時(shí)間提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 4.動物和人

17、體實(shí)驗(yàn)證實(shí)，IgY-IMB-ELISA法可有效地檢測出不同感染度小鼠和感染后不同時(shí)期患者血清中CSEA，提示IgY-IMB-ELISA法是一種敏感性和特異性均較高、操作簡便的血吸蟲循環(huán)抗原的檢測方法。
　　 5.動物實(shí)驗(yàn)證明，經(jīng)吡喹酮有效治療后，感染小鼠血清和尿液中CSEA分別于治療后6周和8周消失，提示IgY-IMB-ELISA法不僅可區(qū)分現(xiàn)癥感染和既往感染，還可用于療效考核。
　　 6.動物實(shí)驗(yàn)證明，IgY-IMB-