麝冰合劑對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦卒中是當(dāng)今世界上最重要的致死性疾病之一，中國(guó)人群腦卒中發(fā)病率、死亡率在總死亡中所占比例，城市為20％，農(nóng)村為19％。而在腦卒中中，缺血性中風(fēng)占80％以上。臨床上處理腦缺血性損傷的原則是盡早恢復(fù)血液再灌注，然而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)缺血區(qū)的血供后，在一定程度上反而更加重了缺血性腦損傷，使腦細(xì)胞死亡數(shù)量進(jìn)一步增加，加重病情，這種血流再通后引起的繼發(fā)性損傷稱(chēng)為腦缺血再灌注損傷(cerebralischemia reperfusion injury

2、 CIRI)，腦缺血再灌注損傷的存在使腦組織的功能障礙和結(jié)構(gòu)損傷更嚴(yán)重，死亡率更高，大大降低了治療效果，引起世人的廣泛關(guān)注，成為近年來(lái)腦缺血研究的一個(gè)熱點(diǎn)。 腦缺血再灌注損傷是一復(fù)雜的病理生理過(guò)程，其具體機(jī)制目前尚不完全清楚。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，腦血流中斷和再灌注使腦的細(xì)胞產(chǎn)生損傷是一個(gè)快速的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)包括許多環(huán)節(jié)，如能量障礙、氧自由基的大量釋放、細(xì)胞酸中毒、興奮性氨基酸釋放增加、細(xì)胞內(nèi)鈣失穩(wěn)態(tài)、自由基生成、凋亡基因激

3、活等。這些環(huán)節(jié)互為因果，彼此重疊，并相互聯(lián)系，形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡或壞死。 血循環(huán)重建后的再灌注性腦損傷日益增多，但目前還沒(méi)有理想的治療腦缺血再灌注損傷的藥物。導(dǎo)師彭勝權(quán)教授根據(jù)長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐，認(rèn)為腦為元神之府，清竅之所在，腦主神明，臨床腦卒中的患者的病機(jī)主要是清竅閉阻，氣血逆亂，故提出腦卒中的早期治療應(yīng)以芳香開(kāi)竅為主，用藥時(shí)可以麝香、冰片為主，再結(jié)合患者個(gè)體差異，辨證論治。麝香可“通諸竅之不利，開(kāi)經(jīng)絡(luò)之壅遏”，是治療

4、腦病和其它危重疾病的常用藥物。冰片亦是開(kāi)竅醒神的常用藥，多用于中風(fēng)，痰熱，神昏竅閉等癥，常作輔藥或引經(jīng)藥用，與麝香同用，可加強(qiáng)其療效。 基于以往臨床與實(shí)驗(yàn)研究的成果，本課題從實(shí)驗(yàn)研究角度從整體和分子水平全面去探討麝香配伍冰片抗腦缺血再灌注損傷的機(jī)制。拓寬中藥防治腦缺血再灌注損傷的思路，為提高中藥的臨床療效提供科學(xué)依據(jù)。 1 麝冰合劑抗大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的療效觀察 1.1 局灶性腦缺血再灌注大鼠模型的復(fù)制與

5、評(píng)價(jià) 目的：復(fù)制SD大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，并評(píng)價(jià)效果。 方法：通進(jìn)改良線(xiàn)栓法建立中動(dòng)脈腦缺血再灌注模型，并對(duì)模型進(jìn)行早期行為學(xué)及組織學(xué)觀察評(píng)價(jià)。 結(jié)果：大鼠表現(xiàn)為不同程度的局灶性神經(jīng)功能障礙，肉眼觀察缺血側(cè)大腦組織腫脹明顯，光鏡下觀察腦神經(jīng)細(xì)胞多數(shù)神經(jīng)細(xì)胞核固縮，細(xì)胞外空隙明顯增寬，間質(zhì)疏松，顯示細(xì)胞周?chē)伴g質(zhì)水腫。 結(jié)論：成功復(fù)制了 MCAO 模型。 1.2 麝冰合劑對(duì)局灶性腦缺血再灌注大

6、鼠行為學(xué)及腦梗死體積影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究麝香配伍冰片對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠行為學(xué)及腦梗死體積的影響。 方法：TTC 染色法檢測(cè)腦梗死體積，并比較其神經(jīng)功能行為積分。 結(jié)果：腦缺血 2h再灌注 24h，模型組腦梗死體積顯著增大，與假手術(shù)組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，神經(jīng)功能行為積分顯著升高(P<0.01)；麝香配伍冰片組腦梗死體積較模型組縮小(P<0.01)，同時(shí)，麝香冰片組、麝香組大鼠神經(jīng)功能行為積

7、分下降(P<0.05)。其中以麝香配伍冰片組作用最明顯。 結(jié)論麝香配伍冰片可減少局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積，改善腦缺血后神經(jīng)行為癥狀。 1.3 麝冰合劑對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦含水量及血腦屏障通透性的影響 目的：研究麝香配伍冰片對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦含水量及血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)通透性的影響。 方法：干濕重法觀察腦含水量的變化，通過(guò)收集透出腦血管外的伊文思藍(lán)

8、(Evans Blue，EB)來(lái)示蹤BBB的變化。 結(jié)果：腦缺血2 h再灌注24h，模型組較假手術(shù)組腦含水量及EB含量明顯增加(P<0.01)，血腦屏障遭到破壞；麝香配伍冰片組腦含水量較模型組明顯降低 (P<0.05)，麝香配伍冰片組及冰片組EB 含量較模型組明顯降低 (P<0.01)。 結(jié)論：麝香配伍冰片可有效降低腦缺血再灌注后腦含水量及血腦屏障的通透性，對(duì)血腦屏障結(jié)構(gòu)有一定的保護(hù)作用。 1.4 麝冰合劑對(duì)局灶

9、性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究麝香配伍冰片對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)的影響。 方法：運(yùn)用透射電鏡觀察大腦頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)及突觸的變化。 結(jié)果：腦缺血2h再灌注24h，大腦皮層神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)損壞明顯，可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞縮小，線(xiàn)粒體腫脹，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張等病變。麝香配伍冰片對(duì)大腦皮層神經(jīng)元有不同程度的保護(hù)或修復(fù)作用。模型組較假手術(shù)組神經(jīng)氈內(nèi)突觸明顯減少(P<0.01)

10、，典型的突觸結(jié)構(gòu)遭到破壞；麝香配伍冰片組突觸數(shù)量較模型組明顯增多 (P<0.05)，突觸形態(tài)大部分接近正常。 結(jié)論：麝香配伍冰片可有效防止腦缺血再灌注導(dǎo)致的皮質(zhì)內(nèi)突觸數(shù)量的減少，對(duì)神經(jīng)元及神經(jīng)元突觸超微結(jié)構(gòu)有一定的保護(hù)作用。 2 麝冰合劑抗大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的分子機(jī)制研究 2.1 麝冰合劑對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠 AQP-4 mRNA 表達(dá)影響的研究 目的：研究麝香配伍冰片對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠

11、腦組織 AQP-4 mRNA 表達(dá)的影響。 方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)制備 TaqMan 探針進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組缺血側(cè)腦組織 AQP-4 mRNA 表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，麝香配伍冰片組、冰片組、缺血側(cè)腦組織 AQP-4 mRNA 表達(dá)明顯降低(P<0.05)。 結(jié)論：麝香配伍冰片組和冰片組可明顯抑制 AQP-4 mRNA 的表達(dá)。 2.2 麝冰合劑對(duì)

12、局灶性腦缺血再灌注大鼠 ICAM-1 mRNA 表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)研究 目的：研究麝香配伍冰片對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織 ICAM-1 mRNA 表達(dá)的影響。 方法：應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，通過(guò)制備TaqMan探針進(jìn)行測(cè)定。 結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組缺血側(cè)腦組織ICAM-1 m=RNA 表達(dá)量明顯增加(P<0.01)。與模型組比較，各組缺血側(cè)腦組織 ICAM-1 tuRNA 表達(dá)均明顯降低(P<0.05～

13、0.01)，其中麝香冰片組下降最明顯(P<0.01)。 結(jié)論：麝香配伍冰片可抑制腦缺血再灌注后ICAM-1 的表達(dá)，從而抑制腦缺血再灌注時(shí)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附，減輕缺血性腦損傷。 3 本課題的特色和創(chuàng)新性 麝香及冰片單味藥的基礎(chǔ)和臨床研究國(guó)內(nèi)外都有著較豐富的資料，但是使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)從整體和分子水平全面系統(tǒng)評(píng)價(jià)這一藥對(duì)抗腦缺血再灌注損傷的作用尚屬首次。在模型方面我們采用了與臨床病人發(fā)病情況相類(lèi)似的SD大鼠MCAO

14、局灶性腦缺血再灌注模型，運(yùn)用早期行為學(xué)及組織學(xué)觀察評(píng)價(jià)，通過(guò)改良線(xiàn)栓法成功復(fù)制了此模型，穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。在國(guó)內(nèi)外之前的有關(guān)腦缺血再灌注損傷研究中，AQP-4與ICAM-1的傳統(tǒng)的檢測(cè)方法均為RT-PCR方法或免疫組化法，我們首次運(yùn)用了實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，通過(guò)制備AQP-4與ICAM-1基因的TaqMan探針，以重組質(zhì)粒為模板繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)研究麝香配伍冰片對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織腦水腫相關(guān)基因AQP-4 mRNA 與炎癥反