γ照射對小鼠NO的影響及其損傷機制的初步研究.pdf

1、研究背景：
　　 輻射是廣泛存在于宇宙和人類生存環(huán)境中的自然現(xiàn)象。輻射按本質(zhì)可分為兩大類；一類是電磁輻射,另一類是粒子輻射。電磁輻射僅有能量而無靜止質(zhì)量；粒子輻射既有能量又有靜止質(zhì)量。按與物質(zhì)的作用方式,又可把輻射分為兩類:電離輻射和非電離輻射。非電離輻射不能引起生物組織發(fā)生電離作用。電離輻射的直接作用是指射線直接將能量傳遞給生物分子,引起電離和激發(fā),導(dǎo)致分子結(jié)構(gòu)的改變和生物活性的喪失。
　　 電離輻射作用于機體,從照射

2、之時起到細(xì)胞學(xué)觀察到可見損傷的這段時間內(nèi),在細(xì)胞中進(jìn)行著輻射損傷的原初和強化過程。這個原初作用過程包括物理、物理化學(xué)和化學(xué)三個階段。在此過程中輻射能量的吸收和傳遞、分子的激發(fā)和電離、自由基的產(chǎn)生、化學(xué)鍵的斷裂等都是在有高度組織的生物體內(nèi)進(jìn)行的。能量的吸收和傳遞使細(xì)胞中排列有序的生物大分子處于激發(fā)和電離狀態(tài),特殊的生物結(jié)構(gòu)也使電子傳遞和自由基連鎖反應(yīng)得以進(jìn)行,這樣導(dǎo)致了初始的生物化學(xué)損傷。由于亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞引起了酶的釋放,代謝的方向性和

3、協(xié)調(diào)性的紊亂促使初始的生物化學(xué)損傷進(jìn)一步發(fā)展,引起機體內(nèi)一系列的生理生化變化直至發(fā)生病變。
　　 電離輻射可引起自由基的生成。自由基的生成是電離輻射誘發(fā)化學(xué)鍵斷裂等生物化學(xué)過程和細(xì)胞組織器官系統(tǒng)直到整體發(fā)生病變的生物學(xué)階段的重要因為。NO是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型的生物信息遞質(zhì),具有獨特的理化和生物學(xué)特性。它是生物體內(nèi)一種極不穩(wěn)定、很快被氧化成硝酸鹽或亞硝酸鹽的結(jié)構(gòu)簡單、具有氧化還原特性的氮氧自由基,體內(nèi)含量少,濃度極低。生物體內(nèi)產(chǎn)

4、生的NO是一種無色、微溶于水,半衰期為3～5s,脂溶性較強,在生物體內(nèi)可以自由地通過生物膜的氣體物質(zhì)。機體以L2精氨酸和活性氧為底物在一氧化氮合酶(NOS)的作用下產(chǎn)生NO。NO在機體作用具廣泛性,雙向性。它參與體內(nèi)一系列生理和病理條件下的生物過程,調(diào)節(jié)循環(huán)、神經(jīng)、免疫等一系列生理活動,如血管擴(kuò)張、血管通透性、血小板粘附和聚集、神經(jīng)信號傳遞、宿主防御反應(yīng)等,同時也參與包括腫瘤在內(nèi)的病理過程。其生成不足或過量,均會引起身體各系統(tǒng)的異常而發(fā)

5、生疾病。
　　 目前發(fā)現(xiàn)NOS主要有3型[3],第1型為神經(jīng)型NOS(nNOS),主要存在于神經(jīng)組織中；第2型為誘導(dǎo)型NOS(iNOS),主要存在于巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等的胞漿內(nèi)；第3型為內(nèi)皮型NOS(eNOS),主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞。其中nNOS和eNOS正常情況下存在于細(xì)胞內(nèi),稱為結(jié)構(gòu)型NOS(cNOS)。cNOS通常情況下合成NO的量少,主要參與機體正常生理功能的維持。iNOS可由炎癥刺激等作用而誘生大量的NO,主要參與機體

6、的病理生理過程。
　　 機體受到一定的應(yīng)激因素作用后,體內(nèi)iNOS的合成增加,進(jìn)一步導(dǎo)致NO的含量增加。電離輻射作為一個外界刺激因子,當(dāng)其作用于機體時,會導(dǎo)致iNOS的增加,進(jìn)而誘導(dǎo)NO的合成[12]。機體受照后,如何確定機體的受照劑量一直是放射醫(yī)學(xué)的研究重點。造血組織是輻射敏感組織,機體受照后造血組織變化的嚴(yán)重程度和照射劑量關(guān)系密切,其損傷程度可以大致估計患者的受照劑量[9]。有學(xué)者研究表明,在巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞體外照射后,

7、iNOS的表達(dá)增加,并導(dǎo)致NO的形成增加[4,5],體內(nèi)實驗也發(fā)現(xiàn),大劑量射線照射后,腮腺等NO合成大量增加,并可能和輻射引起的口干燥癥有關(guān),受照動物肝臟NO也有變化[6]。有人也提出血中NO濃度可能也反應(yīng)機體的受照強度,但是并沒有做深入研究[7]。肝臟是體內(nèi)NO合成的重要器官,因為肝實質(zhì)細(xì)胞,Kupffer細(xì)胞,肝竇內(nèi)皮細(xì)胞均能合成NO。iNOS在正常情況下不表達(dá),在病理狀態(tài)下iNOS被誘導(dǎo),持續(xù)產(chǎn)生大量NO。NO對肝臟既有保護(hù)作用,

8、也有損害作用,既參與許多生理過程,又參與許多病理過程[19]。不同的量,在不同的狀態(tài)下起不同作用。研究NO在輻射后肝臟中的表達(dá),將有助于肝臟生理、病理過程的進(jìn)一步提示,并對輻射后肝臟疾病的防治找到新的途徑。
　　 基因組DNA和細(xì)胞膜是輻射的靶分子。作為輻射的重要靶分子,DNA在電離時極易發(fā)生結(jié)構(gòu)的改變,它們在細(xì)胞的突變及癌變機制中有重要作用,與細(xì)胞老化和死亡也有緊密關(guān)系。電離輻射可使各種真核細(xì)胞分裂延遲,出現(xiàn)G1和G2期阻滯,

9、S期蓄積和巨細(xì)胞形成。明顯的G2期阻滯在輻射較小劑量(2Gy)時即可出現(xiàn)[15]。G1期阻滯在輻射后是否出現(xiàn)視細(xì)胞內(nèi)P53情況而定。一般認(rèn)為只有表達(dá)野生型P53基因的細(xì)胞輻射后才有G1期阻滯的發(fā)生,P53基因有突變或缺失時則無[16]。長時間暴露的NO造成DNA損傷時,P53會聚集于此,通過抑制iNOS啟動子活性而降低其表達(dá),以此保護(hù)細(xì)胞免受NO損害[4]。因此,近年來,iNOS與P53關(guān)系的研究也日益引起學(xué)者們的關(guān)注。P53突變發(fā)生于

10、G:C-T:A轉(zhuǎn)換,這正是NO作用的主要靶點。NO與P53構(gòu)成負(fù)反饋調(diào)節(jié)通路。輻射可以誘導(dǎo)DNA的損傷,導(dǎo)致P53聚集,并抑制iNOS啟動子的活性,抑制其翻譯,使其表達(dá)下調(diào)。過量的NO還可使p53蛋白變形,失去結(jié)合DNA的活性,從而喪失生物學(xué)功能。因此,P53控制NOS的轉(zhuǎn)錄,而NO則控制P53轉(zhuǎn)錄后的活性。NO及iNOS與P53的反饋調(diào)節(jié)影響細(xì)胞的增殖和凋亡。
　　 研究目的：
　　 通過本研究,我們希望能找到輻射損傷

11、后,外周血NO濃度及肝臟NO濃度的變化并且探討其變化規(guī)律,以了解NO的變化在輻射損傷發(fā)生、發(fā)展中的作用。以期為輻射事故后確定機體受照劑量提供科學(xué)依據(jù):并且初步探討N0、iNOS和P53在放射性肝臟損傷過程中的變化及其意義。
　　 研究方法
　　 1.健康NIH小鼠飼養(yǎng)及照射
　　 健康NIH小鼠,雄性,體質(zhì)量(18～25)g,在廣州市輻照中心用60Co γ輻射源(劑量率0.3Gy/min)對小鼠進(jìn)行致死劑量(9.

12、0Gy)和半數(shù)致死劑量(6.5Gy)的照射。
　　 2.檢測致死劑量和半數(shù)致死劑量照射后動物外周血中NO含量的變化情況。
　　 用一氧化氮檢測試劑盒分別檢測致死劑量和半數(shù)致死劑量照射后動物外周血中NO含量的變化情況。
　　 3.檢測致死劑量照射下,小鼠血清及肝臟中NO的變化
　　 NO檢測試劑盒分別檢測致死劑量照射后血清和肝臟組織上清中的NO含量。
　　 4.免疫組化SABC法檢測肝臟組織中iNO

13、S和p53的表達(dá)
　　 對小鼠進(jìn)行致死劑量和半數(shù)致死劑量的照射,照射后分別于3、6、9、12小時取肝臟組織,采用SABC染色法對iNOS和p53蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測,在高倍鏡下,隨機取5個視野,每個視野計數(shù)300個細(xì)胞,算出陽性表達(dá)細(xì)胞總數(shù)。然后采用SPSS統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,對iNOS和p53進(jìn)行相關(guān)性分析,并對不同變量間進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　 結(jié)果及討論
　　 在6.5 Gy和9.0 Gy的輻射劑量下,受射小鼠

14、外周血N0濃度變化趨勢均呈先升高,并在6 h達(dá)到峰值,然后趨于正常值的趨勢。這說明小鼠受到大劑量射線照射應(yīng)激后,機體通過一定的應(yīng)激方式,導(dǎo)致外周血NO濃度含量呈現(xiàn)一過性的升高,當(dāng)經(jīng)過一定時間后,外周血NO濃度又回到正常值范圍內(nèi)。
　　 6.5 Gy和9.0 Gy的輻射劑量照射下,盡管兩者的外周血NO濃度均在受照后3 h出現(xiàn)具有統(tǒng)計學(xué)意義的升高,并在6h達(dá)到峰值,但9.0 Gy γ輻射劑量下其變化幅度較6.5 Gy Y輻射劑量明顯

15、,兩者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。這些都表明,不同劑量照射下,機體的反應(yīng)程度不同,致死劑量照射下,機體的反應(yīng)更強烈。因此認(rèn)為輻射損傷后動物外周血NO濃度變化趨勢在一定的時間范圍內(nèi)可以反應(yīng)機體的受照程度。至于其能否作為一個新型的生物劑量計,將有待于今后進(jìn)一步的研究。
　　 在9.0 Gy劑量照射下,在照后一定的時間后,外周血和肝細(xì)胞的NO濃度和照前相比明顯升高,并且能持續(xù)一段時間,至照后24h,兩者的NO濃度恢復(fù)至照前水

16、平。這說明,電離輻射作為一個刺激因子,也能使血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞、肝細(xì)胞等產(chǎn)生應(yīng)激,從而導(dǎo)致外周血和肝細(xì)胞NO濃度的明顯升高。
　　 小鼠在照射后,肝臟iNOS和P53的表達(dá)也隨著時間增加而升高,在6小時達(dá)到最高,并繼續(xù)在較高水平表達(dá)持續(xù)一段時間,與NO的表達(dá)相一致。說明iNOS、P53和NO三者之間存在著緊密的聯(lián)系。雖然從陽性細(xì)胞計數(shù)可以看到,9.0Gy組陽性細(xì)胞數(shù)多于6.5Gy組,但并不存在統(tǒng)計學(xué)差異。說明在本實驗中,6.

17、5 Gy和9.0 Gy這二個劑量之間與iNOS和P53的表達(dá)并無關(guān)系。但對于其它劑量間有無關(guān)系,還需進(jìn)一步實驗來揭示。iNOS和P53的表達(dá)在不同時間點上存在著統(tǒng)計學(xué)差異,提示iNOS、P53在NO的發(fā)生、發(fā)展存在著密切關(guān)系。在6.5Gy和9.0Gy二個劑量組中,存在同樣的正相關(guān)。當(dāng)機體受到電離輻射時,iNOS表達(dá)升高,產(chǎn)生NO,NO造成細(xì)胞DNA損害時,可觸發(fā)p53的蓄積,p53可通過結(jié)合人iNOS基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游區(qū)來抑制iNOS