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文檔簡介
1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染與肝癌的發(fā)生具有十分密切的關(guān)系,乙肝病毒X蛋白(HBx)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有十分重要的作用。然而,HBx的致癌作用機(jī)理目前仍不十分清楚。我們實驗室前期研究工作發(fā)現(xiàn),在HBx導(dǎo)致的惡性轉(zhuǎn)化過程中,HBx、survivin和HBXIP三者形成復(fù)合物協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能,HBx和survivin扮演了至關(guān)重要的角色,HBXIP不但發(fā)揮橋梁功能連接HBx和survivin,使三者形成復(fù)
2、合物;而且本身還具有重要的致癌作用。為了進(jìn)一步闡明HBx與肝癌發(fā)病的關(guān)系,本研究應(yīng)用人正常肝細(xì)胞系,探討了HBx和survivin對HBXIP的上調(diào)作用,對其分子機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)研究。
主要研究內(nèi)容分為三個部分:
一、HBXIP基因啟動子的鑒定及其功能分析
實驗室前期工作建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因和survivin基因的細(xì)胞系,分別命名為LO2-X、L-O2-S和L-O2-X-S,以此作為研究HBX
3、IP啟動子的細(xì)胞模型。為了篩選HBXIP基因啟動子的功能片段,以細(xì)胞基因組為模板,通過NCBI篩選出HBXIP基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游序列并設(shè)計多對引物,PCR擴(kuò)增后將其產(chǎn)物連接到T載體進(jìn)行測序鑒定;測序成功后將該基因亞克隆至pGL3-Basic熒光報告基因載體上;瞬時轉(zhuǎn)染LO2-X-S、H74O2、HepG2等細(xì)胞系,然后用雙熒光報告檢測系統(tǒng)檢測不同片段的熒光活性。結(jié)果顯示,P-3233/-1673(包含CREB結(jié)合位點)的熒光素酶活性是
4、pGL3-Basic的8倍以上,而其他啟動子片段(不包含CREB結(jié)合位點)熒光素酶活性則相對較低。這表明P-32331/-1673區(qū)域內(nèi)存在調(diào)節(jié)HBXIP轉(zhuǎn)錄的順時作用元件,同時CREB結(jié)合位點可能在HBXIP的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控中起一定作用。
二、HBx和survivin對HBXIP啟動子甲基化水平的影響分析
本實驗室的前期研究工作已證明HBXIP發(fā)揮橋梁的功能連接HBx和survivin使三者形成復(fù)合物導(dǎo)致正常
5、肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。我們在共轉(zhuǎn)HBx和survivin的細(xì)胞系LO2-X-S中通過RT-PCR發(fā)現(xiàn)HBXIP在mRNA水平上調(diào),免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBXIP蛋白表達(dá)水平上調(diào)。為了在表觀遺傳修飾水平闡明HBx和survivin協(xié)同上調(diào)HBXIP的分子機(jī)制,我們應(yīng)用硫酸鹽DNA測序法檢測了HBXIP啟動子的甲基化水平。結(jié)果顯示,相對于LO2,LO2-X,LO2-S細(xì)胞系,LO2-X-S細(xì)胞系中HBXIP啟動子的三個CpG島-2165/-217
6、1,-2282/-2287和-2326/-2330處于低甲基化狀態(tài),這與HBXIP表達(dá)上調(diào)相一致。該結(jié)果表明,HBx和survivin可共同誘導(dǎo)HBXIP啟動子區(qū)域的去甲基化從而促進(jìn)其表達(dá)。
三、HBx和survivin通過CREB轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)HBXIP的轉(zhuǎn)錄
已有文獻(xiàn)報道HBx蛋白可與轉(zhuǎn)錄因子cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋(cAMPresponse element-binding protein,CREB)結(jié)合來調(diào)
7、節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄。我們通過對HBXIP啟動子序列分析發(fā)現(xiàn),HBXIP啟動子序列中含有cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element,CRE)。本研究應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn),HBx蛋白可與HBXIP基因相結(jié)合,但干擾CREB后HBx蛋白則不能與HBXIP基因結(jié)合。說明HBx蛋白可通過轉(zhuǎn)錄因子CREB來調(diào)控HBXIP的表達(dá)。那么survivin在該過程中發(fā)揮什么作用呢?為了說明這一問題,我們將survivin干擾后用HB
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