N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物-LY52抗腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移作用研究.pdf

1、腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移是指癌細(xì)胞脫離原發(fā)部位，侵入新環(huán)境并生長的過程。主要包括：1．癌細(xì)胞穿過基底膜；2．侵入原發(fā)部位血管、淋巴管；3．侵入繼發(fā)部位并降解和穿透基底膜；4．在繼發(fā)部位生長。基質(zhì)金屬蛋白酶(matrixmetall proteinases，MMPs)降解基底膜對(duì)上述過程起到核心作用。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的28種MMPs中，根據(jù)其特異性降解底物不同，分為4類，即膠原酶、明膠酶(IV型膠原酶)、間質(zhì)溶解素和基質(zhì)溶解素。其中，明膠酶(MMP-2和

2、MMP-9)降解膠原蛋白，是產(chǎn)生浸潤與轉(zhuǎn)移的核心酶。因此，以IV型膠原酶為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)新型藥物是抗轉(zhuǎn)移研究的熱門課題。以X線衍射技術(shù)研究MMPs的3-D結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)明膠酶的活性結(jié)合腔(active S’l pock of matrix metalloproteinase)具有比MMP．3更狹長的特點(diǎn)。因此，徐文方等參考MMP-3抑制劑結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)合成了以結(jié)構(gòu)細(xì)長，柔性較高為特點(diǎn)的吡咯烷連接咖啡酰為基本骨架的全新結(jié)構(gòu)化合物，N1-取代咖啡酰吡咯烷

3、衍生物。在設(shè)計(jì)理論上，已經(jīng)具備較易進(jìn)入明膠酶active S’<,l> pocket的能力。本項(xiàng)研究是在體內(nèi)外初步活性篩選有效基礎(chǔ)上，選擇其中的典型化合物-LY52，進(jìn)一步研究其活性作用并探討機(jī)制。 1．瘤細(xì)胞生長抑制實(shí)驗(yàn) (1)體外實(shí)驗(yàn)：以MTT法檢測LX52對(duì)人卵巢上皮癌SKOV3和人喉上皮細(xì)胞癌-IIep-2的生長抑制作用。結(jié)果顯示，LY52對(duì)腫瘤細(xì)胞僅有較弱的生長抑制作用。(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：以100mg/Kg劑量

4、口服給藥，LY52對(duì)S180小鼠肉瘤有一定的抑制作用，對(duì)小鼠體重沒有明顯影響。 2．腫瘤細(xì)胞黏附性抑制實(shí)驗(yàn) (1)細(xì)胞-基質(zhì)蛋白黏附實(shí)驗(yàn)：與LY52孵育12h，MTT法測定細(xì)胞與基底膜蛋白的黏附能力，顯示LY52能夠分別降低SKOV3和Hep-2與FN，LN和Matrigel的黏附性。 (2)CD44表達(dá)實(shí)驗(yàn)：以流式細(xì)胞儀測定了腫瘤細(xì)胞表面黏附分子CD44表達(dá)，結(jié)果顯示LY52對(duì)CD44表達(dá)有較弱的抑制作用。

5、 3．明膠酶活性實(shí)驗(yàn) (1)以琥珀酰明膠降解法，觀察到LY52具有直接抑制明膠酶降解琥珀酰明膠的作用。 (2)SDS-PAGE明膠酶譜分析細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMPs活性，發(fā)現(xiàn)LY52對(duì)SKOV3細(xì)胞MMP-2和-9的表達(dá)具有明顯的劑量依賴性抑制作用關(guān)系；對(duì)Hep-2細(xì)胞表達(dá)MMP-2的活性也有很強(qiáng)的抑制作用。 4．MMP-2，-9表達(dá)抑制實(shí)驗(yàn) (1)免疫細(xì)胞化學(xué)分析法發(fā)現(xiàn)，LY52對(duì)體外培養(yǎng)的SKOV3細(xì)

6、胞MMP-2和MMP-9表達(dá)具有很強(qiáng)的抑制作用；對(duì)Hep-2細(xì)胞MMP-2的表達(dá)也有抑制作用。 (2)免疫組織化學(xué)法，分析裸鼠體內(nèi)生長的SKOV3和Hep-2組織細(xì)胞MMP-2，-9表達(dá)水平，結(jié)果顯示，LY52能夠抑制SKOV3組織細(xì)胞MMP-2和MMP-9的表達(dá)；對(duì)Hep-2細(xì)胞MMP-2也有較弱的抑制作用。 5．腫瘤轉(zhuǎn)移抑制實(shí)驗(yàn) (1)重組基底膜實(shí)驗(yàn)：以transwell chamber實(shí)驗(yàn)法觀察了IY52對(duì)

7、SKOV3和Hep-2細(xì)胞穿過人工基底膜的影響。LY52能夠明顯減少穿過人工基底膜細(xì)胞的數(shù)量，顯示具有抗癌細(xì)胞侵襲與游走的能力。 (2)小鼠Lewis肺癌轉(zhuǎn)移抑制實(shí)驗(yàn)：以C57BL/BL6小鼠接種Lewis肺癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型，觀察了LY52對(duì)其自發(fā)性肺轉(zhuǎn)移的抑制作用，100 mg/Kg能夠有效降低肺表面的轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)量。 (3)B16-F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移抑制實(shí)驗(yàn)：以C57BIJBL6小鼠尾靜脈注射B16-F10細(xì)胞法，

8、LY52能夠降低小鼠肺表面轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量。 6．微血管形成實(shí)驗(yàn) (1)VEGF表達(dá)實(shí)驗(yàn)：免疫組化法檢測了裸鼠體內(nèi)生長的人腫瘤組織SKOV3和Hep-2的VEGF表達(dá)，顯示LY52對(duì)腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞VEGF表達(dá)有明顯的抑制作用。 (2)MVD評(píng)價(jià)法：以CD34表達(dá)水平評(píng)價(jià)腫瘤微血管密度MVD，顯示LY52對(duì)人SKOV3和Hep-2細(xì)胞的腫瘤組織微血管形成因子CD34表達(dá)具有一定的抑制作用。 (3)雞胚尿囊

9、膜(CAM)血管生成實(shí)驗(yàn)：LY52直接與雞胚尿囊膜(CAM)接觸，能夠明顯地抑制CAM血管生成作用。 結(jié)論：LY52特異性地與癌細(xì)胞MMP-2，-9結(jié)合并抑制活性表達(dá)，癌細(xì)胞降解基底膜的能力降低；LY52并能阻滯癌細(xì)胞與基底膜(BM)蛋白的黏附性，細(xì)胞游走能力減弱，穿過人工基底膜的能力下降；由于BM的降解產(chǎn)物減少，腫瘤微血管形成能力降低；以Lewis肺癌和B16-F10黑色素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LY52對(duì)MMP-2，-9活性的