羥基脯氨酸小分子類(lèi)肽化合物對(duì)Ⅳ型膠原酶活性作用篩選及LY52抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用研究.pdf

1、研究背景與目的： 腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移是指癌細(xì)胞脫離原發(fā)部位，侵入新環(huán)境并生長(zhǎng)的過(guò)程。主要包括：1.癌細(xì)胞穿過(guò)基底膜；2.侵入原發(fā)部位血管、淋巴管；3.侵入繼發(fā)部位并降解和穿透基底膜；4.在繼發(fā)部位生長(zhǎng)?；|(zhì)金屬蛋白酶《matrix metalloproteinases，MMPs)降解基底膜對(duì)上述過(guò)程起核心作用。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的28種MMPs中，根據(jù)其底物不同，分為4類(lèi)，膠原酶、明膠酶(Ⅳ型膠原酶)、間質(zhì)溶解素和基質(zhì)溶解素。其中，腫瘤細(xì)胞

2、高表達(dá)Ⅳ型膠原酶(MMP-2,-9)并降解基底膜是腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，Ⅳ型膠原酶成為研究腫瘤轉(zhuǎn)移的核心酶，以該酶為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)化合物是抗轉(zhuǎn)移藥物研究的熱門(mén)課題。富含羥基脯氨酸的膠原蛋白是MMP-2,-9的天然底物，羥基脯氨酸可能是MMP-2,-9的主要識(shí)別位點(diǎn)，設(shè)計(jì)含有羥基脯氨酸骨架的化合物可能較大程度地提高對(duì)MMP-2結(jié)合選擇性。以x線(xiàn)衍射技術(shù)分析MMPs的3-D結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)MMP-2,-9活性結(jié)合腔(active S’<,1> po

3、cket ofmatrix metaUoproteinase)具有比MMP-3更狹長(zhǎng)的特點(diǎn)。因此，徐文方等分析參比化合物CGS27023A：和Bestatin等化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)后，設(shè)計(jì)合成了以結(jié)構(gòu)細(xì)長(zhǎng)，柔性較高為特點(diǎn)的多個(gè)系列羥基脯氨酸小分子類(lèi)肽化合物用于對(duì)Ⅳ型膠原酶抑制活性的篩選和抗腫瘤轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，包括N1-取代咖啡酰吡咯烷小分子類(lèi)肽化合物和N1-取代沒(méi)食子酰吡咯烷化合物；N1-乙酰基取代吡咯烷類(lèi)化合物和環(huán)亞胺類(lèi)肽化合物等。本項(xiàng)研究以Ⅳ型膠

4、原酶為靶點(diǎn)，在篩選活性化合物基礎(chǔ)上，對(duì)N1-取代咖啡酰吡咯烷小分子類(lèi)肽化合物L(fēng)Y52進(jìn)行了重點(diǎn)研究。 實(shí)驗(yàn)方法：化合物的活性篩選實(shí)驗(yàn)，以琥珀酰明膠降解法檢測(cè)化合物對(duì)人Ⅳ型膠原酶活性抑制作用；以MTT法檢測(cè)化合物對(duì)人卵巢上皮癌細(xì)胞SKOV3生長(zhǎng)的影響，評(píng)價(jià)其對(duì)細(xì)胞的作用性質(zhì)；以SDS-FAGE明膠酶譜分析SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2,-9水平，評(píng)價(jià)化合物對(duì)酶活性的影響。研究N1-取代咖啡酰吡咯烷小分子類(lèi)肽化合物L(fēng)Y52抗腫瘤

5、侵襲與轉(zhuǎn)移作用，實(shí)驗(yàn)分五部分： 1.觀(guān)察化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用：以MTT法分別觀(guān)察對(duì)SKOV3和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的生長(zhǎng)抑制作用； 以細(xì)胞克隆生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)法，觀(guān)察較長(zhǎng)接觸時(shí)間，化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；以臺(tái)盼藍(lán)染色方法，檢查化合物處理細(xì)胞藍(lán)染細(xì)胞比例，評(píng)價(jià)化合物對(duì)腫瘤紐胞抑制作用性質(zhì)。 2.評(píng)價(jià)化合物對(duì)SKOV3和MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)MMP-2和：MMP-9活性的抑制作用：以CoA刺激MDA-M

6、B-231細(xì)胞膜表面pro-MMP-2活性轉(zhuǎn)化，SDS-PAGE分析培養(yǎng)上清液中MMP-2水平；以Western blotting和免疫組織化學(xué)法等分別檢測(cè)體外培養(yǎng)和裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的人腫瘤細(xì)胞表達(dá)MMP-2,-9水平。 3.觀(guān)察化合物抑制腫瘤細(xì)胞黏附作用：以MTT法評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞與基底膜蛋白的黏附能力：免疫熒光流式細(xì)胞儀測(cè)定腫瘤細(xì)胞表面黏附分子CD44表達(dá)水平。 4.LY52抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：以transweU c

7、hamber方法觀(guān)察LY52抑制人SKOV3和MDA-MB-231細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的能力；分別以C57BL/BL6小鼠尾靜脈注射B16-F10細(xì)胞法和Lewis肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型，評(píng)價(jià)LY52對(duì)體內(nèi)生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的抑制作甩。 5.觀(guān)察化合物抑制腫瘤微血管形成作用：以Westernblotting法測(cè)定腫瘤細(xì)胞VEGF，TGF-α，bFGF表達(dá)水平；以免疫組織化學(xué)方法檢查裸鼠接種人腫瘤組織CD34表達(dá)，評(píng)價(jià)腫瘤微血管密度(

8、MVD)；將LY52與雞胚尿囊膜(CAM)接觸，觀(guān)察其對(duì)微血管生成的抑制作用。 結(jié)果： 羥基脯氨酸小分子類(lèi)肽化合物對(duì)SKOV3細(xì)胞僅產(chǎn)生較弱的生長(zhǎng)抑制作用，直接與細(xì)胞接觸120 h，劑量100μg/ml以下時(shí)，大多數(shù)化合物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率低于10％；500-1000 μg/ml，最高抑制率15-50％。琥珀酰明膠降解法檢測(cè)化合物對(duì)Ⅳ型膠原酶活性的影響，多數(shù)化合物具有程度不等對(duì)Ⅳ型膠原酶活性抑制作用。SDS-PAGE酶

9、譜分析法檢測(cè)化合物對(duì)SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)液。MMP-2和MMP-9活性影響，從N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物中篩選出了編號(hào)為L(zhǎng)Y52、No21和No26；環(huán)亞胺類(lèi)肽化合物中編號(hào)為11i，11r,Pro-B，9+HNE62，16A，N04，DBC，5+Ala，11a，11u；N1-乙酰基取代吡咯烷類(lèi)肽化合物中編號(hào)為A18，A11，A13，A2等具有抑制MMP-2和：MMP-9活性作用，其中LY52和11i的活性最強(qiáng)。另外，還從N1-乙?；〈?/p>

10、吡咯烷類(lèi)化合物中篩選出A3和A5可能具有促進(jìn)MMP-2和MMP-9降解明膠作用。 對(duì)N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物L(fēng)Y52進(jìn)行了重點(diǎn)研究，與細(xì)胞直接接觸，LY52對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231僅具有較弱的生長(zhǎng)抑制作用。以100 mg/kg口服給藥，對(duì)S180小鼠肉瘤有一定的抑制作用，對(duì)小鼠體重沒(méi)有明顯影響?；衔锱c明膠酶孵育，LY52具有直接抑制明膠酶降解明膠活性；與腫瘤細(xì)胞直接接觸，以SDS-PAGE

11、酶譜分析法發(fā)現(xiàn)LY52明顯抑制SKOV3細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2,-9對(duì)明膠的降解作用，說(shuō)明抑制酶活性；進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，LY52能夠抑制CoA對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞膜表面pro-MMP-2的活化作用，說(shuō)明LY52可能的作用位點(diǎn)是阻止pro-MMP-2向active-MMP-2轉(zhuǎn)化。與SKOV3細(xì)胞孵育12 h，Western MoRmg和免疫細(xì)胞化學(xué)法發(fā)現(xiàn)該化合物對(duì)細(xì)胞表達(dá)MMP-2,-9抑制作用弱，而對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞表達(dá)a

12、ctive-MMP-2水平有較強(qiáng)的抑制作用。與腫瘤細(xì)胞孵育，LY52阻止腫瘤細(xì)胞與基底膜蛋白的黏附能力，并具有較弱降低腫瘤細(xì)胞CD44表達(dá)水平作用。與LY52直接接觸12 h，SKOV3和MDA-MB-231細(xì)胞穿過(guò)人工基底膜的數(shù)量下降，顯示具有抑制細(xì)胞侵襲與游走的能力。以小鼠Lewis肺癌和B16-F10黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，口服給藥3周，100 mg/kg和25 mg/kg劑量均能降低小鼠肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)量，證實(shí)LY52具有抑制動(dòng)物腫瘤

13、自發(fā)肺轉(zhuǎn)移和人工肺轉(zhuǎn)移作用。在微盤(pán)管形成方面，LY52降低腫瘤細(xì)胞微血管生長(zhǎng)因子TGF-α和bFGF的表達(dá)水平，抑制裸鼠體內(nèi)生長(zhǎng)的腫瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)；也能降低腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞CD34表達(dá)，顯示降低腫瘤微血管密度(MVD)，可能與LY52抑制CAM血管生成有關(guān)系。 結(jié)論：以SDS-PAGE酶譜分析法，分別篩選出了N1-取代咖啡酰吡咯烷衍生物L(fēng)Y52、N021和N026，環(huán)亞胺類(lèi)肽化合物11i，11r，Pro-B，9+HNE6

14、2，16A，No4，DBC，5+Ala，11a，11u和N1-乙?；〈量┩轭?lèi)肽化合物A18，A11，A13，A2等具有抑制MMP-2和MMP-9活性作用。另外，N1-乙酰基取代吡咯烷化合物A3和A5可能具有刺激MMP-2和MMP-9降解明膠的作用。LY52抑制癌細(xì)胞MMP-2,-9活性，降解基底膜能力下降，這可能與其阻止pro-MMP-2活性轉(zhuǎn)化機(jī)制有關(guān)。LY52導(dǎo)致癌細(xì)胞與基底膜(BM)蛋白黏附性降低，細(xì)胞游走能力減弱，穿過(guò)人工基