Aurora B小分子抑制劑的高通量篩選及化合物IFVR001抗腫瘤作用初探.pdf

1、蛋白質(zhì)的非正常磷酸化是人類腫瘤等病發(fā)生的重要原因。以蛋白激酶作為藥物靶點(diǎn)，尋找與之相互作用的小分子化合物，并將其中具有激酶活性抑制劑性質(zhì)的小分子化合物用于新藥研發(fā)，是當(dāng)今蛋白激酶研究領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。本研究中，我們以參與染色體分離和胞質(zhì)分裂且又在多種腫瘤組織中過量表達(dá)的AuroraB激酶為靶標(biāo)，對(duì)其小分子抑制劑進(jìn)行了高通量篩選研究。 我們首先建立了AuroraB體外活性蛋白的高效原核表達(dá)體系。通過比較不同融合蛋白的表達(dá)效率和純

2、化效果，依據(jù)融合片段小，表達(dá)效率高，純化效果佳，且具有體外激酶活性等選擇標(biāo)準(zhǔn)，確定將His6-AuroraB原核表達(dá)系統(tǒng)大規(guī)模表達(dá)目標(biāo)蛋白。利用親和純化蛋白方法從發(fā)酵的30升菌液中總共獲得了1000mg具有體外磷酸化活性的AuroraB激酶蛋白。在此基礎(chǔ)上，我們建立了基于同位素標(biāo)記的液體閃爍計(jì)數(shù)蛋白激酶活性測(cè)試方法的AuroraB激酶抑制劑的高通量篩選模型。在此模型中，我們以MBP (Myelin Basic Protein) 作為激酶

3、反應(yīng)的底物。根據(jù)AuroraB的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)特征，確定了適宜于高通量篩選的底物濃度(ATP25uM，MBP20uM)和線性反應(yīng)時(shí)間。在明了化合物溶劑DMSO對(duì)于整個(gè)模型的運(yùn)行無顯著影響后，應(yīng)用已知蛋白激酶抑制劑星孢菌素(Staurosporine)進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，我們構(gòu)建的篩選模型完全符合高通量篩選的要求。 采用這個(gè)高通量篩選模型，我們對(duì)國家新藥篩選中心庫藏的70，000個(gè)小分子化合物進(jìn)行了高通量篩選。在第一輪篩選中，我們

4、在40uM的化合物濃度下，以90％的酶活性抑制率為陽性化合物閾值，篩選到了882個(gè)一級(jí)陽性化合物。然后在4uM化合物濃度，以70％的酶活性抑制率為陽性化合物閾值，從一級(jí)陽性化合物中篩選出76個(gè)二級(jí)陽性化合物。經(jīng)IC<,50>測(cè)試，其中有8個(gè)化合物的IC<,50>位于0～100nM之間，8個(gè)化合物的IC<,50>位于100～500nM之間，12個(gè)化合物的IC<,50>位于500～1000nM之間，其余48個(gè)化合物的IC<,50>位于100

5、0～10000nM之間。 我們隨后考察了其中一個(gè)陽性化合物IFVR001的抑制腫瘤效果，結(jié)果顯示，在細(xì)胞水平，IFVR001能夠顯著的抑制多種腫瘤細(xì)胞系的生長。其中，對(duì)于人類肝癌細(xì)胞系HepG2生長的抑制效果最為強(qiáng)烈，其IC<,50>為0.82uM。對(duì)IFVR001在動(dòng)物水平抑制腫瘤效果的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，該化合物能夠顯著的抑制小鼠肝癌H22的瘤體生長，其抑制效果在相同劑量水平下優(yōu)于已運(yùn)用于臨床腫瘤治療的化療藥物5氟尿嘧啶。IFVR00

6、1與已報(bào)道的Aurom Kmases抑制劑相比較，它具有更強(qiáng)的體外激酶活性抑制效果。 “重大新藥創(chuàng)制”是我國“十一五”科技發(fā)展中長期規(guī)劃中的重大專項(xiàng)研究計(jì)劃之一。其中“從基因到藥物”的新藥創(chuàng)制路線被列為該計(jì)劃的首選策略。本論文的研究工作雖然尚未取得重大的突破性進(jìn)展，但我們?cè)趪倚枰覀內(nèi)ラ_展的研究方向上，進(jìn)行了有益的嘗試，并取得了一些初步的經(jīng)驗(yàn)和若干有價(jià)值的新藥小分子先導(dǎo)化合物。我們還將繼續(xù)努力，在總結(jié)經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上爭取作出更好的

7、成績。 甘氨酸?；D(zhuǎn)移酶(GLYAT)是與哺乳動(dòng)物內(nèi)源和外源羧酸及其異生物的排泄以及脫毒密切相關(guān)的一個(gè)生化代謝酶家族。在代謝過程中，該家族酶類作為一個(gè)重要催化因子催化酰基基團(tuán)從輔酶A硫代酸脂轉(zhuǎn)移到甘氨酸的氨基的轉(zhuǎn)移過程。該家族酶類的異常與哺乳類動(dòng)物的有機(jī)酸血癥及其相關(guān)病理進(jìn)程有密切聯(lián)系。 迄今為止，甘氨酸?；D(zhuǎn)移酶 (GLYAT) 編碼基因的研究資料極為匱乏。我們?cè)谶@里報(bào)道了一個(gè)新的甘氨酸酰基轉(zhuǎn)移酶(GLYAT)編碼基因

8、的分子克隆與初步功能研究。該基因被命名為GLYATL1。其eDNA全長1546bp，開放閱讀框(ORF)編碼一個(gè)全長302個(gè)氨基酸的多肽。GLYATL1基因由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成，定位在染色體11q12.1區(qū)段，與同家族另外兩個(gè)成員毗鄰。組織表達(dá)譜分析表明，GLYATL1在肝臟、腎、胰腺、睪丸、卵巢、胃有存在表達(dá)，其中，在肝臟中表達(dá)強(qiáng)度最高，在腎臟表達(dá)強(qiáng)度次之，在卵巢，睪丸，胰腺，胃中的表達(dá)強(qiáng)度最弱。在cos-7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位