Aurora-B激酶抑制劑的系統(tǒng)篩選與活性化合物的發(fā)現(xiàn)及其分子藥理學(xué)研究.pdf

1、有絲分裂是生物體最基本的生命活動(dòng)過程，能將復(fù)制的基因組精確地分配到子細(xì)胞中，在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中生物體形成了一整套完善的監(jiān)測(cè)機(jī)制以確保遺傳物質(zhì)精確地分配到子細(xì)胞中。Aurora激酶(極光激酶)是細(xì)胞有絲分裂調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的一類重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，在整個(gè)真核生物的進(jìn)化過程中都極為保守。在有絲分裂分裂過程中，Aurora激酶通過BubRl、Mad2、Cenp-E、histone H3等底物的磷酸化來調(diào)節(jié)中心體、紡錘體、染色體或者細(xì)胞骨架的變

2、化，同時(shí)Aurora激酶的活性和定位以及其功能的正常執(zhí)行也受到其上游調(diào)控分子和伙伴分子的調(diào)控。最近幾年的研究表明，在人的多種腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)Aurora激酶家族成員的過表達(dá)，這意味著該家族成員可能與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展有著密切的關(guān)系，被認(rèn)為扮演著原癌基因的角色。 本研究選擇Aurora激酶為靶標(biāo)，建立了利用模式生物．基因突變酵母構(gòu)建了利用微生物發(fā)酵液篩選Aurora激酶抑制劑初篩模型，并利用初篩模型篩選了6000份微生物發(fā)酵液粗提物和

3、2000個(gè)天然與合成化合物，獲得了一組篩選陽性菌株。本研究利用分子生物學(xué)方法，從Hela細(xì)胞中提取總RNA，再通過RT-PCR及PCR手段，得到Aurora-B編碼基因(AURKB)的cDNA，克隆到pMD-18T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒。再將此片斷克隆至表達(dá)載體pET-20b(+)中，構(gòu)建重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化宿主菌-E Coli BL21。IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后通過Ni2+柱親合層析對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得了高純度的重組Aurora-B激酶。

4、為構(gòu)建酶活反應(yīng)體系的Aurora-B抑制劑篩選模型奠定基礎(chǔ)。本研究還以Aurora-B的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，采用虛擬篩選方法，對(duì)Microbial Natural Products Database進(jìn)行了篩選。對(duì)獲得的22個(gè)候選化合物用酵母細(xì)胞篩選模型Y300和ipl1-321進(jìn)行篩選后，得到一個(gè)陽性化合物Jadomycin B。體外酶學(xué)分析證實(shí)JB能抑制Aurora-B激酶的活性；Western Blot分析證實(shí)histone H3的磷酸

5、化水平受到JB的抑制；計(jì)算機(jī)輔助Docking model顯示JB進(jìn)入Aurom-B的活性中心并占據(jù)ATP所在位置，利用MTT進(jìn)行了JB及其衍生物抑制——腫瘤細(xì)胞的活性研究，構(gòu)效關(guān)系研究表明JB唑酮環(huán)上側(cè)鏈對(duì)Jadomycin類的生物活性起決定性作用。 本研究構(gòu)建了初篩與活性評(píng)價(jià)，實(shí)物篩選與結(jié)構(gòu)虛擬篩選相結(jié)合的微生物來源Aurora-B抑制劑的篩選系統(tǒng)。利用這一篩選系統(tǒng)，我們首次發(fā)現(xiàn)了微生物產(chǎn)物Jadomycin B的Auror