土槿乙酸衍生物PB-LY的抗腫瘤作用及其作用機(jī)制研究.pdf

1、目的：土槿皮是我國的一種傳統(tǒng)中藥，土槿乙酸(pseudorlaric acid-B)是其主要的活性成分。近年來研究發(fā)現(xiàn)土槿乙酸及其衍生物具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性。本實驗室將土槿乙酸單體進(jìn)行相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)改造，得到多種土槿乙酸衍生物，發(fā)現(xiàn)其中PB-LY在體外有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，且具有良好的量效關(guān)系。本課題進(jìn)一步研究PB-LY對體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞和動物移植性腫瘤的抑制作用和特點，并初步探討其作用機(jī)制。 方法和結(jié)果： 1.PB-

2、LY的體外抗腫瘤作用本課題通過體外MTT法發(fā)現(xiàn)PB-LY對多種腫瘤細(xì)胞都有較強(qiáng)的抑制作用，其IC<,50>在1.35μmol/L～5.98μmol/L之間。通過SRB結(jié)果顯示，PB-LY主要是通過抑制腫瘤細(xì)胞生長而起到抗癌作用，對Hela的GI<,50>為0.94μmol/L，但LC<,50>要達(dá)到10.21μmol/L。在不同濃度的PB-IY作用下，通過觀察對Hela、SKOV3細(xì)胞生長曲線的影響，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的增殖活性明顯減弱且具有

3、量效關(guān)系。 2.PB-LY的體內(nèi)抗腫瘤作用體內(nèi)移植腫瘤實驗亦觀察到PB-LY對小鼠實體型肉瘤S180有一定的治療作用。連續(xù)給昆明小鼠腹腔注射PB-LY(40mg/kg/d 及 80mg/kg/d) 10天，對小鼠S180肉瘤的生長抑制率分別為 13.5％和36.5％，大劑量與對照組相比具有顯著性差異，說明PB-LY在體內(nèi)試驗表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。 3.PB-LY對腫瘤細(xì)胞周期的影響本文采用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度(0.

4、5～4.0μmol/L)的PB-LY作用12h、24h和36h后對Hela細(xì)胞的影響。結(jié)果顯示與空白對照組相比PB-LY可使G1期的Hela細(xì)胞比例明顯減少，使細(xì)胞的周期阻斷在G<,2>+M期。 4.PB-LY誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡不同濃度的PB-LY(0.5～2.0μmol/L)作用于Hela細(xì)胞24小時后，用熒光染料Hoechst 33342R寸細(xì)胞進(jìn)行染色，在紫外光激發(fā)下發(fā)藍(lán)色熒光，熒光顯微鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)Hela細(xì)胞凋亡的形態(tài)

5、學(xué)變化。并且隨著PB-LY濃度的增加，細(xì)胞凋亡形態(tài)的變化愈顯著，凋亡細(xì)胞的比例逐漸增多，具有劑量依賴性。在經(jīng)典的DNA降解斷裂檢測實驗中，經(jīng)不同濃度的PB-LY (0.5～4.0μmol/L)作用于Hela和SKOV3細(xì)胞24小時后，抽提富集小分子量DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，呈現(xiàn)典型的“DNA梯子”(DNA ladder)。通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞的DNA含量進(jìn)行測定，可見經(jīng)不同濃度的PB-LY (0.5～4.0μmol/L)作用于Hela

6、細(xì)胞24小時后，對細(xì)胞DNA進(jìn)行熒光染色，于正常G0/G1細(xì)胞群前出現(xiàn)DNA低染細(xì)胞群，稱為“A<,0>細(xì)胞群”或“亞G1細(xì)胞群，Sub-G1”即凋亡細(xì)胞群，該現(xiàn)象被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生凋亡的標(biāo)志之一，且凋亡細(xì)胞的比例隨著PB-LY濃度的升高而增大，呈一定的劑量依賴性。綜上結(jié)果可以認(rèn)為PB-LY能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。 5.PB-LY對腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、P21、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)的影響本文

7、觀察TPB-LY對Hela細(xì)胞凋亡相關(guān)基因P53、P21、Caspase-3、Bcl-2和Bax的mRNA表達(dá)的影響。RT-PCR結(jié)果顯示0.5μmol/L～2.0μmol/L PB-LY 能增加Hela細(xì)胞中P53，Caspase-3和Bax的mRNA的表達(dá)，同時降低了P21和Bcl-2的mRNA的表達(dá)，同對照組相比均有顯著性差異。提示PB-LY誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用是依靠上調(diào)了Caspase-3，P53和Bax mRNA的表達(dá)，同時