以肝星狀細(xì)胞為靶點(diǎn)的N1-乙?；〈量┩轭惢衔顰5抗肝纖維化作用研究.pdf

1、研究背景:肝纖維化(hepaticfibrosis，HF)是多種慢性肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的共同病理基礎(chǔ)，是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段。肝纖維化的實(shí)質(zhì)是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的過度沉積，其中心環(huán)節(jié)是處于靜止期的肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecells，HSCs)的活化和向肌成纖維樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)的合成;與此同時，細(xì)胞外基質(zhì)的降解減少，由此導(dǎo)致了其合成與降解的不平衡促進(jìn)了肝纖維化的形成。因此抑制激活的HS

2、Cs細(xì)胞的活化、增殖及促進(jìn)HSCs細(xì)胞的凋亡成為治療肝纖維化的重要途徑。
　　 目的:CIP-A5是基于基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的結(jié)構(gòu)而設(shè)計(jì)的N1-乙?；〈量┩轭惢衔锏难苌铮恢北灰暈橐环N治療肝硬化的候選化合物。本實(shí)驗(yàn)以體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)為研究對象，觀察CIP-A5對HSC-T6細(xì)胞株的增殖、凋亡及相關(guān)纖維化細(xì)胞因子的影響，從分子生物學(xué)水平闡明CIP-A5抗纖維化的作用機(jī)制。

3、　　 方法:
　　 1.明膠酶活性篩選實(shí)驗(yàn):化合物活性篩選實(shí)驗(yàn)，以琥珀酰明膠降解法檢測化合物CIP-A5對人Ⅳ型膠原酶活性抑制作用;以SDS-PAGE明膠酶譜分析HSC-T6細(xì)胞培養(yǎng)上清液MMP-2、MMP-9水平，評價化合物對酶活性的影響。
　　 2.化合物CIP-A5對大鼠肝星狀細(xì)胞增殖與凋亡的影響:研究CIP-A5抗肝纖維化作用，分別采用MTT法觀察其對HSC-T6生長抑制作用;采用流式細(xì)胞術(shù)觀察其誘導(dǎo)HSC-T

4、6細(xì)胞凋亡的影響;以臺盼藍(lán)染色法，檢查化合物處理后藍(lán)染細(xì)胞的比例，評價化合物對肝星狀細(xì)胞抑制作用性質(zhì)。
　　 3.化合物CIP-A5對大鼠肝星狀細(xì)胞相關(guān)纖維化細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響:以免疫印跡法檢測CIP-A5對活化的肝星狀細(xì)胞HSC-T6中MMP-2、MMP-9及相關(guān)纖維化細(xì)胞因子TGF-β、TNF-α、CTGF的表達(dá)水平，評估CIP-A5作為一種新型化合物用于抗肝纖維化作用的可能。結(jié)果:CIP-A5濃度在5-30ng/ml范

5、圍內(nèi)，與明膠酶直接孵育30min，明膠酶的激活作用從28.4％增加到126.7％;與HSC-T6細(xì)胞接觸24h后，CIP-A5(1-100μg/ml)對培養(yǎng)上清中MMP-2的活性由38.6％提高至190.5％，MMP-9的活性由22.4％增加至170.0％;在與TGF-β共同孵育后，CIP-A5對培養(yǎng)上清中MMP-2的活性由30.0％增加至169.5％，MMP-9的活性由21.4％增加至170.0％;以Westernblot分析發(fā)現(xiàn)該化

6、合物對活化的MMP-2的表達(dá)量由50％提高到160.8％，MMP-9的表達(dá)量也由30.0％增加至109.5％;CIP-A5（1-100μg/ml）經(jīng)過72h共同孵育，TIMP-1的表達(dá)抑制率分別為10.6％，32.8％，51.7％，67.3％及79.5％;在與系列濃度的CIP-A5(1-100μg/ml)共同孵育72h后，TGF-β與TNF-α的表達(dá)呈劑量依賴性降低，其中TGF-β的表達(dá)抑制率從15.7％增加至50％;TNF-α的表達(dá)抑