巖青蘭黃酮的心肌保護作用及機制研究.pdf

1、研究背景：心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是危害人類健康的嚴重疾病，具有“發(fā)病率高，死亡率高，致殘率高，復發(fā)率高”以及“并發(fā)癥多”的特點。近年來CVD的死亡率仍居世界前列，達世界死亡人數的20％，特別是45歲以上男性，65歲以上女性極易出現(xiàn)心血管癥狀，如心肌梗塞，高血壓，心衰，冠心病等，尤其是近年來發(fā)病年齡的年輕化，對人們的健康造成極大威脅。過去CVD被認為屬于血流動力學紊亂的范疇，近年來的治療政策逐漸

2、轉向對疾病發(fā)展的控制，最近研究認為，活性氧(reactive oxygen species，ROS)可能是CVD發(fā)生、發(fā)展的重要參與者，ROS可導致心血管功能失調，細胞凋亡和壞死，內源性抗氧化系統(tǒng)破壞，脂質與蛋白代謝與功能的改變，信號轉導改變，基因表達改變等。因此理論上說抗氧化治療對CVD有很大價值。 阿霉素(Doxorubicin，DXR or DOX)屬葸醌類抗腫瘤抗生素，具有抗瘤譜廣、作用強的特點，在臨床上廣泛用于治療白血

3、病、淋巴瘤等多種惡性腫瘤，因此是目前最常用的抗腫瘤藥物之一，但長期應用可以發(fā)生劑量依賴性心臟毒性。用藥早期即可出現(xiàn)各種心律失常，晚期出現(xiàn)劑量依賴性充血性心力衰竭，表現(xiàn)為不可逆的慢性心肌改變。與其他抗腫瘤藥如環(huán)磷酰胺、博萊霉素、順鉑等合用時，其心臟毒性進一步加重，一旦心力衰竭發(fā)生，其病死率可達33％-70％，因而大大限制了其在臨床上的應用。 中藥作用范圍廣，毒副作用少，能有效地清除氧自由基抗脂質過氧化和調節(jié)鈣離子穩(wěn)定，從而保護心血

4、管系統(tǒng)及阿霉素所致心肌細胞損傷。因此，從天然植物中尋找新型、高效、低毒的，具有多靶位調節(jié)作用的防治藥物仍是藥學研究的重點之一。 我國有著豐富的植物資源，巖青蘭(Dracocephalum rupestre Hance)又名毛建草，為多年生草本植物，廣泛分布于我國遼寧、內蒙、河北、山西、青海等地。全草藥用可清熱消炎、涼血止血，主治外感風熱、頭痛寒熱、喉痛咳嗽、黃疸性肝炎、吐血衄血、痢疾以及外感夾食、胸脘脹滿、消化不良等。其地上全草

5、所含總黃酮給麻醉犬靜脈滴注可以有效緩解急性心肌缺血，同時縮小犬急性心肌梗死面積；犬冠脈流量明顯增加。為了尋找對心肌細胞有保護作用的有效成分，開發(fā)利用該植物資源，本教研室對該植物地上全草進行了系統(tǒng)的化學成分研究，共分離得到多個黃酮類化合物及其苷類化合物。 氧化損傷是心血管疾病和阿霉素心肌損傷的機制之一，故研究藥物的抗氧化分子機制，對于揭示藥物治療心血管疾病和阿霉素心肌損傷具有重要意義。在心肌細胞上表達的抗氧化調節(jié)基因和蛋白主要有N

6、rf2，AREs，ERK1/2等。介導細胞氧化還原反應的信號轉導通路主要是和Nrf2/ARE和MAP激酶信號轉導通路。 Nrf2在細胞漿中與胞漿骨架蛋白-1(cytoskeletal protein 1，Keap 1)結合而呈失活狀態(tài)，Nrf2在細胞漿中磷酸化后轉位到細胞核，相應于PKC和MAP激酶途徑。在細胞核中，Nrf2通過與bZIP家族的轉錄因子包括CREB、ATF4、fos或jun結合而激活AREs，從而調節(jié)二相酶GST

7、-A2，NQO-1，HO-1，GCL，epoxide hydrolase，和UDP-glucuronosyl transferase等的表達。此過程被小maf蛋白包括MafG和MarK所拮抗。另外，心肌細胞凋亡是導致阿霉素性心肌病的主要原因。氧化損傷和鈣超載均能導致心肌細胞凋亡，凋亡通路中Bcl-2和Caspase家族發(fā)揮著重要作用。所以藥物可以從保護氧化損傷、降低鈣超載、作用于通路中的某個環(huán)節(jié)或通過作用于多個靶點而保護心肌細胞。

8、 本實驗通過體外心肌細胞培養(yǎng)，以阿霉素造成心肌損傷模型，觀察巖青蘭黃酮對阿霉素誘導的心肌損傷的保護作用，并進一步探討其分子機制，主要研究柚皮素-7-0-葡萄糖苷的抗氧化機制和抗心肌細胞凋亡機制，分析阿霉素心肌損傷的發(fā)病機制中多個機制尤其是氧自由基和鈣超載以及最終引起心肌細胞凋亡之間的相互關系和交叉點，并進一步從分子水平上闡明該類化合物心肌保護作用的分子靶點，對開發(fā)新的心血管藥物和減少阿霉素的心臟毒性提高其臨床應用的安全性具有重要的理論

9、和實踐意義。 實驗方法： 1.用MTT法對5種巖青蘭黃酮的藥理活性進行初步的篩選，觀察其不同劑量(2.5、5、10、20、40、80μM)對正常心肌細胞和損傷的心肌細胞的增殖作用的影響，檢測正常心肌細胞、阿霉素(20μM)損傷的心肌細胞、及加入巖青蘭黃酮(2.5、5、10、20、40、80μM)作用的各組心肌細胞吸光度。觀察柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40、80μM)對阿霉素(20μM)損傷的心肌細胞活力影響的

10、時效關系，應用試劑盒檢測柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)對心肌細胞內抗氧化酶SOD、CAT、GSH及GSH-Px的水平和MDA的含量的影響。 2.不同劑量柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)對阿霉素(10μM)誘導的心肌細胞凋亡情況檢測：1)瑞氏-吉姆薩和Heochst33258染色后，分別于倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察正常、凋亡、加藥保護的各組細胞的形態(tài)。2)瓊脂糖凝膠電泳分析(DNA ladder

11、)；3)流式細胞儀分析-磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V/PI雙染法)；4)RT-PCR檢測心肌細胞Caspase-3，Caspase-9，Bcl-2和HO-1 mRNA的表達；5)Western blot檢測Bcl-2，HO-1的蛋白表達：6)用Fura-2/AM鈣熒光探針測定細胞內鈣離子濃度。 3.不同劑量柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)對內源性抗氧化酶的誘導作用：1)RT-PCR檢測柚皮素-7-O-

12、葡萄糖苷對心肌細胞GCLM、GCLC和NQO1 mRNA的表達；2)Western blot檢測柚皮素-7-O-葡萄糖苷對NQO1的蛋白表達；3)Western blot檢測柚皮素-7-O-葡萄糖苷對Nrf2的核轉位和磷酸化ERK1/2表達的影響。結果： 1.通過用MTT法對5種巖青蘭黃酮(北美圣草素、北美圣草素-7-O-葡萄糖苷、木犀草素、柚皮素-7-O-葡萄糖苷及化合物 6)的心肌細胞保護作用進行初步的篩選發(fā)現(xiàn)，低劑量(2.

13、5、5、10、20、40μM)的巖青蘭黃酮對正常心肌細胞的增殖無明顯影響，隨著劑量增加，表現(xiàn)出對心肌細胞的增殖有抑制作用；阿霉素損傷的心肌細胞的增殖作用明顯下降。低劑量(2.5、5、10、20、40μM)巖青蘭黃酮對阿霉素損傷的心肌細胞有不同程度的保護作用，其中柚皮素-7-O-葡萄糖苷的保護作用較好。柚皮素-7-O-葡萄糖苷能提高阿霉素損傷的心肌細胞內GSH水平，降低MDA含量，并增強SOD、CAT和GSH-Px的活性，從而對阿霉素誘導

14、的心肌損傷有一定保護作用。 2.柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能保護阿霉素(10μM)誘導的心肌細胞凋亡： 1)形態(tài)學觀察：瑞氏-吉姆薩和Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)正常心肌細胞核形態(tài)完整，核膜清晰，染色均勻，未見核固縮現(xiàn)象。阿霉素(10μM)處理的細胞部分染色質出現(xiàn)固縮、染色質不均勻有邊集現(xiàn)象，部分染色質呈典型半月樣改變；有的形成顆粒，細胞核裂解，產生凋亡小體。柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20

15、、40μM)細胞結構接近正常，少數有染色質輕度邊集、核固縮等形態(tài)學變化。隨著劑量增大，細胞保護作用減弱。 2)瓊脂糖凝膠電泳分析(DNA ladder)發(fā)現(xiàn)柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能減少阿霉素(10μM)誘導的心肌細胞凋亡帶。 3)Annexin V/PI雙染后流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能保護阿霉素(10μM)誘導的心肌細胞凋亡，能降低凋亡率。 4)

16、RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能減少心肌細胞Caspase-3，Caspase-9 mRNA的表達，增加Bcl-2和HO-1 mRNA及其蛋白表達；并能降低心肌細胞內鈣離子濃度。 3.對內源性抗氧化酶的誘導作用：柚皮素-7-O-葡萄糖苷(10、20、40μM)能增加心肌細胞GCIM、GCLC和NQO1 mRNA的表達；上調NQO1的蛋白表達：增加Nrf2的核轉位和磷酸化ERK1/2表達。

17、 結論： 柚皮素-7-O-葡萄糖苷對阿霉素誘導的心肌損傷有一定保護作用，能提高損傷心肌細胞內GSH水平，降低MDA含量、增強SOD、CAT和GSH-Px活力。能抑制心肌細胞內鈣超載、減少Caspase-3，Caspase-9 mRNA的表達、增加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達和誘導心肌細胞內源性抗氧化酶GCL、HO-1和NQO1的表達而對心肌細胞凋亡具有明顯的抑制作用，結果初步證實柚皮素-7-O-葡萄糖苷能通過增加Nrf2核轉