Pim-3對(duì)抗心肌急性損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、上世紀(jì)中葉人們發(fā)現(xiàn)，某些情況下組織器官缺血后恢復(fù)血流，不但不能減輕損傷反而導(dǎo)致?lián)p傷進(jìn)一步加重和器官功能障礙。這種缺血組織在恢復(fù)血液灌注后，超微結(jié)構(gòu)、代謝、功能以及電生理方面發(fā)生進(jìn)一步損傷的現(xiàn)象被稱為缺血/再灌注損傷（ischemia/reperfusion injury，IRI）。近年來(lái)，臨床醫(yī)生發(fā)現(xiàn)在休克治療、心肺腦復(fù)蘇、心絞痛冠脈解痙、心腦血管栓塞再通、體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)、經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)、臟器和肢體移植、外科燒傷植皮等情況

2、下均有IRI發(fā)生，是造成手術(shù)后病人病情惡化的一個(gè)重要原因。如何減少再灌注所造成的損傷已成為當(dāng)前臨床相關(guān)學(xué)科，特別是心胸外科的研究重點(diǎn)。基因治療通過(guò)將基因?qū)霗C(jī)體并發(fā)揮作用，可以賦予心肌抗急性心肌損傷的能力，并且沒(méi)有手術(shù)帶給病人的二次打擊，必將為防治心肌急性損傷帶來(lái)新的曙光。 原癌基因是一類編碼關(guān)鍵性調(diào)控蛋白的正常細(xì)胞基因，在細(xì)胞的生存、生長(zhǎng)、發(fā)育、分化過(guò)程中具有重要的生理功能，當(dāng)原癌基因被激活有可能引起細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)度活躍和/或細(xì)胞

3、死亡受抑制。凋亡是急性損傷過(guò)程中心肌細(xì)胞丟失造成心肌受損的重要原因。原癌基因的運(yùn)用使受損的心肌組織得到有效的修復(fù)并達(dá)到逆轉(zhuǎn)心臟衰竭的目的。已有文獻(xiàn)報(bào)道，心肌的缺血性損傷，通過(guò)原癌基因src，ras，vav酪氨酸激酶所介導(dǎo)的途徑而得以修復(fù)，從而阻止了心力衰竭的發(fā)生。 原癌基因絲/蘇氨酸激酶Pim-3在結(jié)構(gòu)上與Pim-1、Pim-2同屬Pim激酶家族。該家族各成員在激酶結(jié)構(gòu)域上高度同源，其生物學(xué)功能也存在顯著的重疊。與其它絲/蘇氨酸

4、蛋白激酶如P13K-Akt、mTOR等一樣，Pim激酶家族能使在細(xì)胞生長(zhǎng)通路中起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)分子內(nèi)的絲/蘇氨酸殘基磷酸化，并通過(guò)不同于PI3K-Akt-mTOR的另一條通路，促進(jìn)細(xì)胞的生存和繁殖。已證實(shí)多種生長(zhǎng)因子、激素和細(xì)胞生長(zhǎng)通路如JAK/STAT、P13K、Akt等可在不同水平介導(dǎo)Pim的表達(dá)。因此，Pim激酶在細(xì)胞生長(zhǎng)的調(diào)控中起重要作用，并對(duì)細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用。有實(shí)驗(yàn)證明，Pim-3基因在腦組織缺血損傷周圍出現(xiàn)早期高水

5、平的表達(dá)。在組織缺血早期，許多基因的表達(dá)被顯著抑制，但Pim-3基因表達(dá)則被早期誘導(dǎo)，提示它可能對(duì)細(xì)胞的生存和功能恢復(fù)有重要意義。受此啟發(fā)，本課題擬探討在心肌IRI時(shí)Pim-3基因是否具有抗凋亡和對(duì)心肌細(xì)胞生存具有保護(hù)作用。本工作的總體研究思路為： 首先，采用原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞，建立缺氧/復(fù)氧（anoxia/ reoxygenation，A/R）損傷及缺氧預(yù)適應(yīng)（anoxia preconditioning，APC）保護(hù)模型

6、，在用多種經(jīng)典、公認(rèn)的檢測(cè)方法確認(rèn)已造成急性心肌損傷及保護(hù)作用的基礎(chǔ)上，采用分子生物學(xué)檢測(cè)方法，研究Pim-3 mRNA以及蛋白表達(dá)的變化規(guī)律。接著，構(gòu)建Pim-3表達(dá)質(zhì)粒，采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)處理心肌細(xì)胞。在確認(rèn)Pim-3在細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)后，采用多種經(jīng)典、公認(rèn)的檢測(cè)方法研究Pim-3在急性A/R損傷模型與APC保護(hù)模型的作用，闡明Pim-3基因表達(dá)在急性心肌細(xì)胞損傷時(shí)的意義。 然后，在明確Pim-3能對(duì)抗心肌A/R損傷的基礎(chǔ)上，選定

7、心肌細(xì)胞中一條重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPKs通路，MAPKs包括3種主要的亞家族：ERK1/2，JNK和p38 MAPK，研究究竟是哪一個(gè)或哪幾個(gè)MAPKs亞家族介導(dǎo)了心肌細(xì)胞急性損傷時(shí)Pim-3的表達(dá)。 最后，探討Pim-3對(duì)抗心肌急性A/R損傷的機(jī)制，從細(xì)胞凋亡的線粒體信號(hào)途徑入手，闡明Pim-3對(duì)抗心肌急性損傷，發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制。 第一部分：Pim-3在心肌細(xì)胞急性A/R損傷時(shí)的表達(dá)及意義 心肌細(xì)胞凋亡是A

8、/R損傷的一個(gè)重要特征，APC是目前已知的最為強(qiáng)大的對(duì)抗A/R損傷的方法，研究證實(shí)，APC對(duì)抗A/R損傷的機(jī)制主要是上調(diào)一些內(nèi)源性保護(hù)蛋白，這些蛋白能夠抑制心肌細(xì)胞的凋亡，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。原癌基因絲/蘇氨酸激酶Pim-3在結(jié)構(gòu)上與Pim-1、Pim-2同屬Pim激酶家族。大量的實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)，Pim激酶的上調(diào)與細(xì)胞凋亡的抑制存在明顯的相關(guān)性。Pim-3基因在腦組織缺血損傷周圍出現(xiàn)早期高水平的表達(dá)，在組織缺血早期，許多基因的表達(dá)被顯

9、著抑制的情況下，Pim-3基因表達(dá)卻被誘導(dǎo)，表達(dá)上調(diào)，提示可能對(duì)細(xì)胞的生存和功能恢復(fù)有重要意義。因此，本研究采用原代培養(yǎng)新生大鼠的心肌細(xì)胞，建立A/R損傷、APC保護(hù)模型，結(jié)果顯示缺氧預(yù)適應(yīng)能明顯增加Pim-3的表達(dá)，構(gòu)建pcDNA3.1/ Pim-3基因表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示外源性的Pim-3基因的導(dǎo)入能對(duì)抗A/R所致的急性損傷，發(fā)揮類似于缺氧預(yù)適應(yīng)的保護(hù)作用。 第二部分：p38 MAPK通路介導(dǎo)Pim-3在心肌細(xì)

10、胞急性損傷時(shí)的表達(dá) 在前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)缺氧預(yù)適應(yīng)能明顯增加Pim-3的表達(dá)，從而對(duì)抗心肌細(xì)胞的A/R損傷之后，在這一部分我們進(jìn)一步探討了缺氧預(yù)適應(yīng)中Pim-3表達(dá)上調(diào)所涉及的心肌細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路。多項(xiàng)研究證明，MAPKs是缺血、缺氧、牽張、激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等多種細(xì)胞外刺激誘導(dǎo)基因表達(dá)、細(xì)胞增殖等核反應(yīng)的共同通路或匯聚點(diǎn)，多種細(xì)胞外刺激（包括缺血、應(yīng)激、激素、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等），無(wú)論是通過(guò)G蛋白或是酪氨酸蛋白激酶的活化，都

11、可激活Raf→MAPK激酶（MAPK kinase）→MAPK的磷酸化連鎖反應(yīng)，經(jīng)過(guò)MAPK的核轉(zhuǎn)位，引起轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，調(diào)節(jié)原癌基因和應(yīng)激蛋白基因的表達(dá)，促進(jìn)有關(guān)蛋白質(zhì)合成增加，完成對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)。MAPKs包括3種主要的亞家族：ERK1/2，JNK和p38 MAPK。引起ERK1/2激活的主要是生長(zhǎng)因子等有絲分裂刺激，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、分化等核反應(yīng)；JNK and p38 MAPK則在缺血缺氧、應(yīng)激、紫外線、細(xì)胞因子等刺激下被激活

12、，從而影響不同病理?xiàng)l件下細(xì)胞的生物學(xué)行為和組織器官的功能[8]。但是這三條通路在細(xì)胞中的確切作用還不是很清楚。在本實(shí)驗(yàn)中，分別給予這三條通路的特異性阻斷劑阻斷由APC所誘導(dǎo)的活化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻斷ERK1/2和JNK的活化對(duì)Pim-3的表達(dá)沒(méi)有明顯的影響，而阻斷了p38 MAPK的活化，Pim-3的表達(dá)則明顯下降，提示由APC所誘導(dǎo)的Pim-3的表達(dá)升高與p38 MAPK通路有關(guān)。 第三部分：細(xì)胞凋亡的線粒體信號(hào)通路在Pim-3抗心

13、肌急性損傷中的作用 本研究在證實(shí)Pim-3基因轉(zhuǎn)染入心肌細(xì)胞后，逆轉(zhuǎn)了A/R所致的心肌急性損傷的基礎(chǔ)上，對(duì)Pim-3基因產(chǎn)生心肌保護(hù)作用的機(jī)制進(jìn)行探討。凋亡是心肌細(xì)胞A/R損傷過(guò)程中心肌細(xì)胞丟失造成心肌受損的重要原因，Pim-3作為原癌基因具有對(duì)抗凋亡的能力，我們推測(cè)Pim-3抗急性心肌損傷是通過(guò)抑制凋亡而起作用的。凋亡發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制是相當(dāng)復(fù)雜的，近年來(lái)，線粒體信號(hào)途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡機(jī)制研究倍受關(guān)注，認(rèn)為凋亡過(guò)程中線粒體可

14、能起著中心調(diào)控作用，通過(guò)使mPTP過(guò)度開放，造成線粒體腫脹，外膜破裂，釋放CytC至胞漿中導(dǎo)致凋亡發(fā)生。本研究結(jié)果表明，心肌細(xì)胞在遭受A/R損傷時(shí)，線粒體滲透性轉(zhuǎn)換增大，CytC由線粒體向胞漿大量釋放，而Pim-3轉(zhuǎn)染組則明顯抑制了線粒體的腫脹，從而抑制了Cyt C由線粒體向胞漿的釋放，而且改善了心肌細(xì)胞的各項(xiàng)指標(biāo)，起到了心肌保護(hù)作用。這些數(shù)據(jù)證明，mPTP的開放，細(xì)胞色素C從線粒體釋放至胞質(zhì)是引發(fā)凋亡的關(guān)鍵步驟。當(dāng)?shù)蛲龃碳ひ蜃右鸺?xì)胞