靶向Pim-3的雙功能載體對(duì)小鼠黑色素瘤的治療作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的
　　黑色素瘤因其惡性程度極高而成為皮膚惡性腫瘤致死的主要原因之一，高發(fā)的侵襲和轉(zhuǎn)移是其最為顯著的特征和影響患者生存的首要因素。黑色素瘤的發(fā)病主要與紫外線的過(guò)度照射、環(huán)境因素、遺傳因素、外界刺激等因素相關(guān)，目前治療的主要方式包括手術(shù)、化療、放療和藥物治療，但預(yù)后較差，復(fù)發(fā)率高，病死率高。腫瘤細(xì)胞的無(wú)限生長(zhǎng)和機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答之間的相互作用是影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的主要原因，為了有效激活機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，腫瘤免疫治療得到了廣泛的關(guān)注

2、和迅速發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤免疫原性高，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行免疫治療，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，能有效的抑制腫瘤的生長(zhǎng)，這也使得黑色素瘤的免疫治療得到迅速的發(fā)展。Pim-3作為一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，在多種癌癥中異常表達(dá)增加，主要通過(guò)磷酸化特異性底物使其失去活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡減少、增殖增多，最終調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此Pim-3可能成為抗腫瘤治療的一個(gè)新靶點(diǎn)?；谝陨媳尘埃覀儑L試一方面利用具有免疫刺激作用的單鏈RNA（ssRNA）序列激活機(jī)體

3、TLR-7受體，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，活化免疫效應(yīng)細(xì)胞，最終刺激機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，引起機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)癌細(xì)胞的自主殺傷及清除;另一方面我們通過(guò)RNA干擾技術(shù)特異性沉默原癌基因Pim-3的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從腫瘤細(xì)胞本身出發(fā)抑制腫瘤的生長(zhǎng)。結(jié)合以上兩方面的設(shè)想，我們構(gòu)建了靶向沉默Pim-3的雙功能shRNA表達(dá)載體，該載體既能通過(guò)其包含的ssRNA片段活化TLR7受體激發(fā)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，又能通過(guò)shRNA特異性沉默原癌基因

4、Pim-3的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究旨在觀察此雙功能表達(dá)載體對(duì)小鼠黑色素瘤的治療作用，并探討其可能的分子機(jī)制。
　　方法
　　1.以小鼠的黑色素瘤細(xì)胞系B16為主要研究對(duì)象，首先通過(guò)Western-blot檢測(cè)Pim-3在B16細(xì)胞、黑色素瘤組織及正常小鼠皮膚組織中的表達(dá)。
　　2.用脂質(zhì)體將pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到B16細(xì)胞中，通過(guò)qPCR

5、和Western-blot等方法檢測(cè)雙功能載體對(duì)Pim-3的沉默效果;通過(guò)ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后B16細(xì)胞中Ⅰ型干擾素的分泌，以確定TLR信號(hào)通路的活化。
　　3.用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA質(zhì)粒到B16細(xì)胞中，24h后，通過(guò)AnnexinⅤ/PI染色和TUNEL免疫熒光技術(shù)檢測(cè)B16細(xì)胞的凋亡;通過(guò)Western-blot等方法檢測(cè)Bad、p-Bad、BCL-2、

6、BCL-XL等凋亡相關(guān)分子的表達(dá)。
　　4.通過(guò)劃痕、transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)B16細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的變化;通過(guò)qPCR和Western-blot技術(shù)檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo)的變化。
　　5.通過(guò)Western-blot檢測(cè)STAT3、MAPK及NF-κB信號(hào)通路的活化情況，通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)檢測(cè)Pim-3與STAT3之間的結(jié)合，以探討Pim-3調(diào)控B16細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制。
　　6.對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行B

7、16細(xì)胞皮下荷瘤，待腫瘤長(zhǎng)出后給予雙功能載體治療，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，脾臟和腫瘤組織中各淋巴細(xì)胞的比例和活化情況。
　　7.給B16細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSIREN、ssRNA、Pim-3-shRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA質(zhì)粒后，通過(guò)尾靜脈注射轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的B16細(xì)胞，建立黑色素瘤肺轉(zhuǎn)移模型，觀察不同載體治療對(duì)B16黑色素瘤細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移的影響。
　　8.用清除抗體分別對(duì)C57BL/6小鼠NK、CD8+T和pDC細(xì)胞進(jìn)行清除，再

8、對(duì)小鼠進(jìn)行B16細(xì)胞皮下荷瘤，觀察在雙功能載體介導(dǎo)的抗腫瘤作用中，這三種細(xì)胞所發(fā)揮的作用。
　　9.進(jìn)一步觀察pDC細(xì)胞清除后，雙功能載體的抗腫瘤作用及NK、CD8+T細(xì)胞的活化情況。
　　結(jié)果
　　1.Pim-3在正常小鼠皮膚中的表達(dá)極低，而在黑色素瘤細(xì)胞系中明顯高表達(dá)。
　　2.雙功能載體能有效沉默黑色素瘤細(xì)胞中Pim-3的表達(dá)，刺激Ⅰ型干擾素的分泌，引起TLR信號(hào)通路的活化。
　　3.用Pim-3-s

9、hRNA、ssRNA-Pim-3-shRNA載體轉(zhuǎn)染B16細(xì)胞后，B16細(xì)胞的凋亡明顯增加。凋亡相關(guān)分子p-Bad、Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)明顯下調(diào)。
　　4.Pim-3-shRNA，尤其是ssRNA-Pim-3-shRNA表達(dá)質(zhì)粒，能明顯的抑制B16的轉(zhuǎn)移侵襲;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Pim-3的沉默主要通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞EMT過(guò)程的發(fā)生進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲過(guò)程。
　　5.ssRNA和ssRNA-Pim-3-shRNA促進(jìn)

10、NF-κB信號(hào)通路的活化，而Pim-3-shRNA和ssRNA-Pim-3-shRNA沉默Pim-3抑制STAT3的磷酸化，且Co-IP結(jié)果顯示Pim-3和STAT3之間有明顯的結(jié)合。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)沉默Pim-3可抑制STAT3的磷酸化，進(jìn)而減弱EMT過(guò)程，抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲。
　　6.雙功能載體可以顯著抑制B16皮下腫瘤的生長(zhǎng)，同時(shí)能夠增加脾臟和腫瘤局部淋巴細(xì)胞中NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的比例和活化，并且增加pDC的比例。

11、>　　7.清除NK和CD8+T細(xì)胞均可明顯削弱雙功能載體治療對(duì)黑色素瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　8.清除pDC細(xì)胞明顯削弱雙功能載體對(duì)黑色素瘤的治療作用，NK、CD8+T細(xì)胞的比例和活化也減弱。
　　9.Pim-3-shRNA，尤其是ssRNA-Pim-3-shRNA表達(dá)質(zhì)粒，能明顯抑制黑色素瘤的肺轉(zhuǎn)移過(guò)程。
　　結(jié)論
　　1.靶向Pim-3的雙功能載體可以明顯促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的凋亡、抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，并引起p