甘草次酸對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、第一部分甘草次酸對(duì)對(duì)乙酰氨基酚致肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的:研究甘草次酸(GA)對(duì)對(duì)乙酰氨基酚（APAP）致肝損傷的保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討其分子機(jī)制。
　　方法: Balb/c小鼠在APAP腹腔注射前30 min，給予GA(100mg/kg)預(yù)處理，并進(jìn)行血清轉(zhuǎn)氨酶、肝組織學(xué)分析和谷胱甘肽(glutathione，GSH)測(cè)定。分別應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(terminal-deoxynucleoitidyl trans

2、ferase mediated nick end labeling,TUNEL)分析肝細(xì)胞凋亡情況，免疫組織熒光或化學(xué)檢測(cè)激活型caspase-3、高遷移率族蛋白1（high mobility group box1，HMGB1）和F4/80表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)血清腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白細(xì)胞介素

3、(interleukin，IL)-1β水平，western blot檢測(cè)細(xì)胞色素酶P450(cytochrome enzyme P450,CYP)2E1、Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)4、p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)、p-IκB和白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶M(interleukin-1receptor-associated kin

4、ase-M，IRAK-M)和蛋白表達(dá)水平，定量PCR(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction, QRT-PCR)檢測(cè)CYP2E1 mRNA表達(dá)水平，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)分析肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞募集情況。
　　結(jié)果:GA預(yù)處理對(duì)APAP致肝損傷具有保護(hù)作用，包括降低ALT/AST活性、減輕肝臟病理?yè)p傷程度和肝細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)GA可通過(guò)降低CYP2E1的蛋

5、白和mRNA表達(dá)水平抑制APAP代謝，并增高肝臟GSH水平。不僅如此，GA對(duì)APAP刺激誘導(dǎo)的HMGB1增多，p38-MAPK和IκB信號(hào)激活以及TNF-α和IL-1β產(chǎn)生具有抑制作用，但我們發(fā)現(xiàn)TLR4表達(dá)并未受到影響，而IRAK-M的蛋白表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明，GA可減少肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞募集和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。
　　結(jié)論:結(jié)果表明，GA對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝損傷具有保護(hù)作用。一方面，GA可下調(diào)CYP2E1表達(dá)調(diào)節(jié)APAP代謝，增高G

6、SH水平。另一方面，GA可以減少HMGB1釋放和肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞募集及巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制TLR4介導(dǎo)的信號(hào)通路，減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而減輕肝臟在無(wú)菌性炎癥發(fā)生是所承受的二次損傷。但GA并未影響TLR4的表達(dá)，其潛在的分子機(jī)制可能與IRAK-M表達(dá)上調(diào)有關(guān)。
　　第二部分甘草次酸對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭的保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　目的:研究甘草次酸(GA)對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的暴發(fā)性肝衰竭（FHF）的保護(hù)作用，并進(jìn)一步

7、探討其分子機(jī)制。
　　方法: Balb/c小鼠在LPS/D-半乳糖胺(D-GalN)腹腔注射前30min，接受GA(10，30，100 mg/kg)預(yù)處理，并進(jìn)行死亡率、肝組織學(xué)、血清轉(zhuǎn)氨酶測(cè)定。并分別應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA)檢測(cè)肝臟和血清腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)水平。定量PCR(quantitativ

8、e reversetranscription-polymerase chain reaction， QRT-PCR)檢測(cè)肝臟TNF-α mRNA表達(dá)。western blot檢測(cè)Toll樣受體(Toll like receptor,TLR)4、白細(xì)胞介素1受體相關(guān)激酶（interleukin-1 receptor-associatedkinases，IRAKs）1，p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated prote

9、inkinases，MAPKs)、IκB和IRAK-M的蛋白表達(dá)。免疫共沉淀法測(cè)定IRAK-1和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子(tumor necrosis factorreceptor-associated factor, TRAF)的結(jié)合活性。此外，小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7在LPS刺激前，經(jīng)GA(10-5M)預(yù)處理。分別應(yīng)用流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)Toll樣受體(Toll like receptor, TLR)4/髓樣分化因子2(myeloi

10、ddifferentiation factor2，MD2)的表達(dá)。熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)AP-1和NF-κB的活性。western blot檢測(cè)IRAK-M的蛋白表達(dá)。ELISA檢測(cè)上清TNF-α水平。腺病毒IRAK-M siRNA轉(zhuǎn)染干擾巨噬細(xì)胞IRAK-M表達(dá)。
　　結(jié)果:GA預(yù)處理對(duì)LPS/D-GalN誘導(dǎo)的FHF具有保護(hù)作用，包括劑量依賴性降低死亡率、ALT/AST活性以及減輕肝臟病理?yè)p傷程度。同時(shí)，GA可降低LPS/D-G

11、alN誘導(dǎo)的血清和肝組織中TNF-α表達(dá)并抑制p38 MAPK和IκB激活。不僅如此，GA不影響TLR4的表達(dá)，可抑制IRAK-1和TRAF的結(jié)合活性，并上調(diào)IRAK-M表達(dá)。此外，GA處理的巨噬細(xì)胞對(duì)LPS刺激誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生和AP-1、NF-κB轉(zhuǎn)錄活性具有抑制作用，但并未影響到TLR4/MD2水平同時(shí)上調(diào)IRAK-M的表達(dá)。使用IRAK-M的siRNA沉默巨噬細(xì)胞內(nèi)IRAK-M表達(dá)后，GA的保護(hù)作用被抑制。
　　結(jié)論:結(jié)果