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文檔簡介
1、目的:肝病是一類較常見的嚴(yán)重影響人類健康的疾病,若肝損傷長期得不到及時有效的治療,最終會進(jìn)展為肝癌或肝衰竭,顯著降低病人生存質(zhì)量并直接威脅生命。雖然不同的肝病發(fā)生機制各不相同,但有研究表明免疫系統(tǒng)在大多數(shù)發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。伴刀豆蛋白A(Con A)誘導(dǎo)的急性肝損傷模型是一個較理想的T細(xì)胞介導(dǎo)的肝炎小鼠模型,用來模擬人病毒性和自身免疫性肝病。
36個氨基酸多肽片段是本室前期在尋找早期肝炎臨床診斷的生物標(biāo)志物時運用基質(zhì)輔助激
2、光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)從慢性肝炎病人血清中檢測到的一個含量較高的多肽。經(jīng)初步研究發(fā)現(xiàn)該多肽高表達(dá)可改變體外培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞的增殖周期,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。
迄今為止,還沒有關(guān)于該多肽在肝炎動物模型中生理和病理作用的研究,我們推測其可能在肝炎的進(jìn)展過程中發(fā)揮作用,故進(jìn)行本研究。本研究利用Con A誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷模型研究該36個氨基酸多肽片段在免疫誘導(dǎo)的肝損傷中的作用,并初步探討其作用機制,為下
3、一步臨床肝病治療提供實驗依據(jù)。
方法:
1預(yù)防性給予小鼠人工合成的36個氨基酸多肽片段或地塞米松,一小時后注射ConA誘導(dǎo)肝損傷。ConA注射12小時后檢測各組血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)水平,肝組織進(jìn)行石蠟包埋并作HE染色,觀察該多肽預(yù)防性給藥對Con A誘導(dǎo)肝損傷的影響。
2預(yù)防性給予小鼠人工合成的36個氨基酸多肽片段或地塞米松,一小時后給予致死劑量ConA,觀察各組小鼠
4、72小時內(nèi)的死亡情況,進(jìn)行生存分析,進(jìn)一步確定該多肽片段對ConA誘導(dǎo)肝損傷的保護(hù)性作用。
3流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測各組小鼠肝細(xì)胞凋亡及有絲分裂情況,從肝細(xì)胞角度探討該多肽片段在Con A誘導(dǎo)肝損傷過程中的作用機制。
4 FCM檢測各組小鼠肝組織淋巴細(xì)胞(T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKT細(xì)胞)浸潤情況,探討該多肽片段在ConA誘導(dǎo)肝損傷免疫應(yīng)答方面的作用機制。
5通過尾靜脈注射Con A誘導(dǎo)肝損傷,0.5小時后給
5、予36個氨基酸多肽片段進(jìn)行治療,檢測ConA注射后12小時后各組血清ALT和AST水平,肝組織進(jìn)行石蠟包埋并作HE染色,觀察其對Con A誘導(dǎo)肝炎的治療作用。此外,用致死劑量ConA處理小鼠后,用多肽片段或地塞米松治療,觀察其72小時內(nèi)的死亡情況,做生存分析,進(jìn)一步確定該多肽片段對ConA所致肝損傷的治療效果。
結(jié)果:
136個氨基酸多肽片段預(yù)防性給藥對ConA誘導(dǎo)的肝損傷的影響
與模型組相比,各多肽片段及
6、地塞米松預(yù)防性給藥組均顯著降低血清ALT和AST水平(均P<0.05)。HE染色結(jié)果顯示模型組小鼠肝組織出現(xiàn)典型肝壞死表現(xiàn)及淋巴細(xì)胞浸潤;多肽片段75μg/kg組肝細(xì)胞壞死明顯減少,其他劑量組(150μg/kg、300μg/kg和600μg/kg)以及地塞米松組均未見肝細(xì)胞壞死區(qū)域。
236個氨基酸多肽片段預(yù)防性給藥對致死劑量Con A導(dǎo)致的小鼠生存情況的影響
多肽片段和地塞米松預(yù)防性給藥組小鼠生存率分別為70%和8
7、0%,中位生存時間均為72小時,均顯著高于模型組(20%,11小時),可見多肽片段能有效降低小鼠的死亡率(均P=0.004)。
336個氨基酸多肽片段預(yù)防性給藥對肝細(xì)胞周期和凋亡的影響
各多肽片段及地塞米松預(yù)防性給藥組小鼠凋亡肝細(xì)胞所占比例分別為14.73±3.37%,10.01±0.78%,6.41±0.98%,12.86±1.79%,8.4±2.01%,均顯著低于Con A模型組30.24±1.29%,P值均小于
8、0.01;隨著多肽片段劑量增大凋亡細(xì)胞所占比例呈現(xiàn)下降趨勢,當(dāng)多肽片段達(dá)到600μg/kg時凋亡細(xì)胞所占比例出現(xiàn)上升。多肽片段600μg/kg組G0/G1期肝細(xì)胞所占比例顯著高于模型組,G2/M期和S期肝細(xì)胞所占比例顯著低于模型組(均P<0.01);多肽片段75μg/kg、150μg/kg和300μg/kg組G2/M肝細(xì)胞所占比例均低于模型組(均P<0.05);地塞米松組G0/G1期肝細(xì)胞所占比例顯著高于模型組,G2/M期和S期肝細(xì)胞所
9、占比例顯著低于模型組(均P<0.01)。
436個氨基酸多肽片段預(yù)防性給藥對肝組織淋巴細(xì)胞浸潤數(shù)量的影響
各多肽片段預(yù)防性給藥組小鼠肝組織浸潤T細(xì)胞、NK細(xì)胞及NKT細(xì)胞比例與模型組相比無明顯差異,地塞米松組T細(xì)胞和NKT細(xì)胞比例顯著低于模型組(均P<0.01)。
536個氨基酸多肽片段對ConA所引起的肝損傷的治療作用
多肽片段治療組和地塞米松治療組血清ALT和AST水平均顯著低于模型組(均P<
10、0.01),HE染色均未見明顯肝細(xì)胞壞死區(qū)域。對致死劑量ConA誘導(dǎo)的肝損傷,多肽片段治療后小鼠生存率和中位生存時間分別為50%和58小時,地塞米松治療后小鼠生存率和中位生存時間分別為60%和72小時,兩組的生存率和中位生存時間均顯著高于模型組(20%,13小時,P<0.026,P<0.011),說明治療性給藥也可提高小鼠生存率和中位生存時間。
結(jié)論:
1外源性給予36個氨基酸多肽片段可有效預(yù)防和治療ConA誘導(dǎo)的肝
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