科羅索酸對(duì)酒精性肝損傷的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景
　　過(guò)度飲酒所引起的健康問(wèn)題和社會(huì)問(wèn)題在世界范圍普遍存在，可引起精神異常，胰腺損傷，心肌損傷等。肝臟作為乙醇的主要代謝器官，大量飲酒可對(duì)肝臟造成損害，進(jìn)而發(fā)展為酒精性肝病(Alcoholic liver disease，ALD)。ALD的發(fā)病進(jìn)程包括酒精性脂肪肝，酒精性肝炎，肝纖維化，肝硬化及肝癌。酒精性肝病的致死率居高不下。直至目前為止，ALD的發(fā)病機(jī)制并不十分明朗，并且相關(guān)治療方式和藥物存在一定的局限性。
　　

2、酒精性脂肪肝是酒精性肝病發(fā)病的前期階段，并且存在可逆性，其特點(diǎn)為肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常蓄積和脂質(zhì)代謝異常，其中腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinesis，AMPK)和其下游分子乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)及固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein-1c，SERBR-1c)在酒精所致的肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝

3、異常中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。諸多研究發(fā)現(xiàn)AMPK及其下游分子ACC和（或）SERBR-1c異常表達(dá)可促進(jìn)肝臟中甘油三酯蓄積。
　　酒精性脂肪肝進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致酒精性肝炎，在這一過(guò)程中肝細(xì)胞凋亡（apoptosis）作用關(guān)鍵。諸多學(xué)者發(fā)現(xiàn)有絲分裂原激活蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinas，MAPK)信號(hào)通路和自噬參與調(diào)節(jié)乙醇所引起的肝細(xì)胞凋亡。MAPK家族包括p38和JNK，是重要的信號(hào)傳導(dǎo)分子，

4、可通過(guò)改變p38和（或）JNK磷酸化將細(xì)胞外的信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)。許多研究發(fā)現(xiàn)自噬在維持肝細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)非常重要，其能消化降解細(xì)胞內(nèi)病源物質(zhì)，損傷細(xì)胞器和失去正常功能的蛋白質(zhì)，進(jìn)而幫助肝細(xì)胞在各種應(yīng)激狀態(tài)下保持正常功能。同時(shí)肝細(xì)胞自噬可受AMPK通路調(diào)節(jié)，AMPK通路的激活可上調(diào)自噬水平。
　　科羅索酸是源自枇杷葉的提取物，屬于三萜化合物類(lèi)，具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝，影響MAPK通路和AMPK信號(hào)的作用，已被用來(lái)研究治療糖尿病，高血脂，動(dòng)脈粥樣

5、硬化，非酒精性脂肪肝等多種疾病。然而科羅索酸對(duì)于酒精性肝病發(fā)展的影響及機(jī)制研究并不十分明確。故在本次實(shí)驗(yàn)中，我們旨在探究科羅索酸對(duì)于酒精性肝病發(fā)展進(jìn)程中肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常和肝細(xì)胞凋亡的影響，并研究其內(nèi)在作用機(jī)制。
　　第一部分:科羅索酸對(duì)乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響及機(jī)制研究
　　研究目的:
　　通過(guò)乙醇培養(yǎng)BRL-3A和HepG2細(xì)胞體外模擬乙醇所致的肝細(xì)胞脂質(zhì)代謝異常，研究科羅索酸干預(yù)對(duì)這一

6、過(guò)程的影響及相應(yīng)作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng):
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，使用含有不同濃度乙醇，科羅索酸，compound C的培養(yǎng)基培養(yǎng)BRL-3A和HepG2細(xì)胞相應(yīng)時(shí)間。
　　2.甘油三酯含量測(cè)定:
　　收集空白對(duì)照組，不同濃度乙醇處理組和各個(gè)藥物干預(yù)組的細(xì)胞，采用酶法（甘油三酯檢測(cè)試劑盒）測(cè)定對(duì)照組和各個(gè)處理組中細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(Triglyceride， TG)的表達(dá)情況，并進(jìn)行記錄分析。<

7、br>　　3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR）檢測(cè):
　　提取正常對(duì)照組和不同實(shí)驗(yàn)組BRL-3A和HepG2細(xì)胞RNA，使用PCR儀檢測(cè)細(xì)胞中β-actin和SREBP-1c基因表達(dá)情況。
　　4.免疫蛋白印跡(Western blot)檢測(cè):
　　提取正常對(duì)照組，不同濃度乙醇處理組和各個(gè)藥物干預(yù)組細(xì)胞蛋白，使用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中磷酸化AMPK(p-AMPK)，

8、AMPK，磷酸化ACC(p-ACC)和ACC表達(dá)情況，使用Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　研究結(jié)果:
　　1.乙醇刺激對(duì)BRL-3A和HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)合成的影響:
　　采用酶法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)含量明顯增加，呈濃度依賴(lài)性。
　　2.科羅索酸對(duì)乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)堆積的影響:
　

9、　采用酶法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與100mM乙醇刺激組相比，科羅索酸組BRL-3A和HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三脂(TG)含量明顯降低，呈濃度依賴(lài)性。
　　3.科羅索酸對(duì)乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中AMPK/ACC通路的影響采用Western blot技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞中p-AMPK，AMPK，p-AMPK，AMPK蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞p-AMPK

10、/AMPK比值和p-ACC/ACC比值均下降;與乙醇刺激組相比，科羅索酸組細(xì)胞中p-AMPK/AMPK比值和p-ACC/ACC比值均上調(diào);說(shuō)明科羅索酸上調(diào)乙醇所抑制的AMPK通路，并抑制乙醇所激活的ACC通路;而科羅索酸這些效能可被compound C(AMPK通路抑制劑)所削弱。
　　4.科羅索酸對(duì)乙醇刺激下 BRL-3A和HepG2細(xì)胞中SREBP-1c表達(dá)的影響:
　　采用RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中SREBP-1c m

11、RNA的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中SREBP-1c mRNA的表達(dá)量上調(diào)，呈濃度依賴(lài)性;與乙醇刺激組相比，科羅索酸組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中SREBP-1c mRNA的表達(dá)下降，呈濃度依賴(lài)性。
　　5.compound C影響科羅索酸對(duì)乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用:
　　采用酶法和RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量和SREBP-1c

12、mRNA表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在同樣存在乙醇刺激的情況下，與科羅索酸組相比，compound C干預(yù)可增加細(xì)胞中甘油三酯含量，上調(diào)SREBP-1c mRNA的表達(dá)。
　　研究結(jié)論:
　　1.乙醇刺激可引起B(yǎng)RL-3A和HepG2細(xì)胞內(nèi)甘油三酯蓄積。
　　2.在BRL-3A和HepG2細(xì)胞中，科羅索酸通過(guò)激活A(yù)MPK通路，抑制ACC通路活性和SREBP-1c的表達(dá)來(lái)減輕乙醇刺激所引起的甘油三酯蓄積。
　　第二部分:科

13、羅索酸對(duì)乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制
　　研究目的:
　　觀(guān)察科羅索酸干預(yù)對(duì)乙醇刺激下BRL-3A和HepG2細(xì)胞損傷凋亡的影響，并探究其相關(guān)作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.細(xì)胞分組:
　　按照實(shí)驗(yàn)需要分為:正常對(duì)照組，乙醇處理組，乙醇+科羅索酸處理組，乙醇+科羅索酸+巴佛洛霉素A1處理組，乙醇+科羅索酸+3-MA處理組，乙醇+科羅索酸+compound C處理組，乙醇+科

14、羅索酸+BAPTA-AM處理組，乙醇+科羅索酸+毒胡蘿卜素(thapsigargin)處理組。
　　2.MTT檢測(cè):
　　將細(xì)胞種于96孔板中，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求加入乙醇或是藥物干預(yù)24小時(shí)后，使用MTT檢測(cè)各組細(xì)胞的存活情況。
　　3.細(xì)胞蛋白免疫印跡檢測(cè)(western-blot):
　　提取各處理組細(xì)胞蛋白，使用western-blot檢測(cè)各組細(xì)胞中β-actin, bax，bcl-2，p38，磷酸化p38(p-

15、p38)，JNK，磷酸化JNK（p-JNK），beclin-1，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ，p-AMPK和AMPK的表達(dá)情況，并使用Image J分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　4.ELISA檢測(cè):
　　收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)TNF-α濃度并進(jìn)行計(jì)算。
　　5.細(xì)胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)和鈣離子濃度檢測(cè)
　　收集各組細(xì)胞后，分別使用ROS熒光探針，鈣離子熒光探針和流

16、式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)細(xì)胞中ROS、Ca2+濃度，并使用Flow Jo分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　研究結(jié)果:
　　1.乙醇培養(yǎng)對(duì)BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活的影響
　　采用MTT方法檢測(cè)乙醇刺激對(duì)BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活率明顯降低，呈濃度依賴(lài)性。
　　2.科羅索酸對(duì)乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活的影響
　　采用MTT

17、方法檢測(cè)不同濃度科羅索酸對(duì)乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與乙醇刺激組相比，科羅索酸組BRL-3A和HepG2細(xì)胞的存活率明顯升高，呈濃度依賴(lài)性。
　　3.科羅索酸對(duì)乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞凋亡的影響
　　采用western-blot檢測(cè)各處理組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白bax和bcl-2的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中bax/bcl-2比

18、值明顯上調(diào);與乙醇刺激組相比，科羅索酸組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中bax/bcl-2的比值明顯下調(diào)，呈濃度依賴(lài)性;說(shuō)明科羅索酸抑制了乙醇所引起的肝細(xì)胞凋亡。
　　4.科羅索酸對(duì)乙醇培養(yǎng)下BRL-3A細(xì)胞炎癥的影響
　　采用ELISA檢測(cè)各處理組BRL-3A細(xì)胞上清液中TNF-α的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組細(xì)胞上清液中TNF-α的含量明顯增高;與乙醇刺激組相比，科羅索酸組細(xì)胞上清液中TNF-α表達(dá)

19、明顯降低;說(shuō)明科羅索酸抑制了乙醇所致的肝細(xì)胞炎癥。
　　5.科羅索酸對(duì)乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中活性氧(ROS)生成的影響
　　采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中活性氧生成情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中活性氧含量明顯增高;與乙醇刺激組相比，科羅索酸組細(xì)胞中活性氧含量明顯降低，呈濃度依賴(lài)性。
　　6.科羅索酸對(duì)乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和He

20、pG2細(xì)胞中MAPK通路的影響
　　采用western blot檢測(cè)各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中磷酸化p-38(p-p38)，p-38，磷酸化JNK(p-JNK)和JNK的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組細(xì)胞中p-p38/p38比值和p-JNK/JNK比值均上調(diào);與乙醇刺激組相比，科羅索酸組細(xì)胞p-p38/p38比值和p-JNK/JNK比值明顯下調(diào)，呈濃度依賴(lài)性;說(shuō)明科羅索酸抑制了乙醇所激活的p38

21、MAPK和JNK MAPK通路。
　　7.科羅索酸對(duì)乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中自噬狀態(tài)的影響
　　采用western-blot技術(shù)檢測(cè)各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中自噬相關(guān)分子beclin-1和LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組細(xì)胞中beclin-1表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯降低;與乙醇刺激組相比，科羅索酸組細(xì)胞beclin-1表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ

22、比值均明顯上調(diào)，呈濃度依賴(lài)性;說(shuō)明科羅索酸上調(diào)了乙醇所抑制的自噬水平。
　　8.3-MA,科羅索酸對(duì)乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞存活情況的影響
　　采用MTT檢測(cè)各處理組細(xì)胞存活情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在同樣的100mM乙醇刺激下，3-MA干預(yù)明顯降低了科羅索酸所升高的細(xì)胞存活率，說(shuō)明科羅索酸在BRL-3A和HepG2細(xì)胞中是通過(guò)激活自噬減輕乙醇刺激下的細(xì)胞凋亡。
　　9.科羅索酸影響乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和He

23、pG2細(xì)胞中自噬狀態(tài)的相關(guān)機(jī)制
　　采用western-bolt技術(shù)檢測(cè)各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中p-AMPK、AMPK和beclin-1表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組細(xì)胞內(nèi)p-AMPK/AMPK比值下調(diào)，beclin-1表達(dá)降低;與乙醇刺激組相比，科羅索酸組細(xì)胞p-AMPK/AMPK比值增高，beclin-1表達(dá)增高;而科羅索酸這一調(diào)節(jié)作用可被compound C(AMPK通路抑制劑)所逆轉(zhuǎn)。<

24、br>　　10.鈣離子在科羅索酸影響乙醇培養(yǎng)下BRL-3A和HepG2細(xì)胞中自噬狀態(tài)中的作用
　　采用細(xì)胞流式術(shù)檢測(cè)各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中胞漿鈣離子濃度情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇刺激組胞漿鈣離子濃度明顯增高;與乙醇刺激組相比，科羅索酸組胞漿鈣離子濃度明顯降低。采用western-bolt技術(shù)檢測(cè)各處理組BRL-3A和HepG2細(xì)胞中beclin-1表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與科羅索酸組相比，BAPTA

25、-AM組和thapsigargin組細(xì)胞內(nèi)beclin-1表達(dá)無(wú)明顯改變。Thapsigargin組的胞漿內(nèi)鈣離子濃度和ROS含量均高于科羅索酸組。
　　研究結(jié)論:
　　1.科羅索酸可抑制乙醇刺激所引起的BRL-3A和HepG2細(xì)胞凋亡，并且是通過(guò)下調(diào)乙醇所激活的ROS/MAPK通路和上調(diào)乙醇抑制的自噬水平而實(shí)現(xiàn)。
　　2.在BRL-3A和HepG2細(xì)胞中，科羅索酸通過(guò)激活乙醇所抑制的AMPK通路而上調(diào)自噬水平。

26、>　　第三部分:科羅索酸對(duì)酒精灌胃大鼠肝臟損傷的影響及作用機(jī)制
　　研究目的:
　　觀(guān)察科羅索酸干預(yù)對(duì)乙醇灌胃處理Sprague Dawley(SD)大鼠肝臟損傷的影響，并探究其相關(guān)作用機(jī)制。
　　研究方法:
　　1.SD大鼠分組情況
　　將健康30只雄性SD大鼠隨機(jī)均分為分為正常對(duì)照組，乙醇處理組和科羅索酸治療組。正常對(duì)照組每日2次生理鹽水灌胃，使用量與乙醇處理組的酒精量相同。乙醇處理組大鼠使用60％紅星

27、二鍋頭灌胃，在實(shí)驗(yàn)第1，4，8，12周稱(chēng)重，按照1-4周4.5克（乙醇）/千克（體重）/天，5-8周6.5克（乙醇）/千克（體重）/天，912周9克（乙醇）/千克（體重）/天，每天兩次進(jìn)行灌胃，間隔12小時(shí)?？屏_索酸干預(yù)組，在進(jìn)行相同酒精灌胃處理同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)5-12周加入科羅索酸每天4ml20％灌胃。
　　2.SD大鼠肝臟組織病理染色
　　采用伊紅蘇木素(HE)染色檢測(cè)各組SD大鼠肝臟病理?yè)p傷情況;采用油紅染色檢測(cè)各組大鼠肝

28、臟脂質(zhì)堆積情況。
　　3.western blot檢測(cè)SD大鼠肝臟中各目的蛋白的表達(dá)
　　提取各組大鼠肝臟組織蛋白，采用western blot檢測(cè)β-actin，bax，bcl-2，p38，p-p38，JNK，p-JNK，beclin-1，LC3Ⅱ/LCⅠ，p-AMPK和AMPK的表達(dá)情況，并借助Image J軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
　　研究結(jié)果:
　　1.科羅索酸干預(yù)對(duì)乙醇刺激下SD大鼠肝臟病理情況的影響

29、　　使用HE染色和油紅染色顯示各組大鼠肝臟病理?yè)p傷。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組SD大鼠相比，乙醇處理組大鼠肝臟呈現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞腫脹和脂質(zhì)堆積;與乙醇處理組相比，科羅索酸組SD大鼠肝臟中炎癥反應(yīng)，肝細(xì)胞腫脹和脂質(zhì)堆積明顯減輕。
　　2.科羅索酸對(duì)乙醇刺激下SD大鼠肝臟細(xì)胞凋亡情況的影響
　　使用western-blot技術(shù)檢測(cè)各組SD大鼠肝臟中bax和bcl-2蛋白表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇處理組

30、大鼠肝臟中bax/bcl-2比值明顯增高;與乙醇處理組相比，科羅索酸組大鼠肝臟中bax/bcl-2比值明顯下降;說(shuō)明科羅索酸可減輕乙醇刺激所引起的大鼠肝組織細(xì)胞凋亡。
　　3.科羅索酸對(duì)乙醇刺激下SD大鼠肝臟中MAPK通路的影響
　　使用western-blot技術(shù)檢測(cè)各組大鼠肝臟中p-38，p-p38，JNK和p-JNK蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組相比，乙醇處理組大鼠肝臟中p-p38/p38比值和p-JNK/JNK

31、比值均明顯增高;與乙醇處理組相比，科羅索酸組大鼠肝臟中p-p38/p38比值和p-JNK/JNK比值均明顯下調(diào);說(shuō)明科羅索酸抑制了乙醇刺激所引起的大鼠肝組織中p38 MAPK和JNK MAPK通路的激活。
　　4.科羅索酸對(duì)乙醇刺激下SD大鼠肝臟中自噬狀態(tài)的影響及相關(guān)機(jī)制
　　使用western-blot技術(shù)檢測(cè)各組SD大鼠肝臟中AMPK，p-AMPK，beelin-1和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:與正常對(duì)照組

32、相比，乙醇處理組大鼠肝臟中p-AMPK/AMPK比值，beclin-1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯降低;與乙醇處理組相比，科羅索酸組大鼠肝臟中p-AMPK/AMPK比值，beclin-1蛋白表達(dá)和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均明顯增高;說(shuō)明科羅索酸上調(diào)了乙醇刺激所抑制的大鼠肝組織中AMPK/自噬通路。
　　研究結(jié)論:
　　1.科羅索酸可改善乙醇灌胃大鼠肝臟的病理?yè)p傷和脂質(zhì)堆積。
　　2.科羅索酸可減輕乙醇灌胃大鼠肝