rhFGF-21對心肌缺血再灌注損傷保護機制的蛋白質(zhì)組學研究.pdf

1、目的：
　　 1.觀察成纖維細胞生長因子-21(rhFGF-21)對H9c2心肌細胞I/RI的保護作用。
　　 2.驗證rhFGF-21通過抗細胞凋亡發(fā)揮保護H9c2細胞作用。
　　 3.驗證rhFGF-21通過抗氧化應激、抗炎發(fā)揮保護H9c2細胞作用。
　　 4.驗證rhFGF-21通過Akt/GSK-3β發(fā)揮保護H9c2細胞作用。
　　 5.運用蛋白質(zhì)組學探索rhFGF-21保護I/RI更多可

2、能的藥理作用機制。
　　 6.驗證rhFGF-21通過改善細胞能量代謝發(fā)揮H9c2細胞保護作用。
　　 方法：
　　 1.在模型Ⅰ、Ⅱ的基礎上給予梯度濃度的rhFGF-21處理，之后CCK-8法測定各組相對存活率。
　　 2.在模型Ⅱ的基礎上給予梯度濃度的rhFGF-21處理，之后用Hoechst33258熒光染料對細胞核染色，觀察細胞核改變;用Stains-All染料對細胞進行著色，觀察細胞形態(tài)變化;用

3、Western-Blot方法檢測各組中Caspase-3蛋白表達量的改變。
　　 3.在模型Ⅱ的基礎上給予梯度濃度的rhFGF-21處理，之后采用DHE熒光探針檢測細胞內(nèi)超氧陰離子，Western Blot檢測炎癥因子TNF-α、PAI-1表達量。用qPCR檢測模型Ⅰ組、Ⅱ組中H9c2細胞內(nèi)rhFGF-21表達情況。CCK-8法檢測rhFGF-21對H2O2處理H9c2細胞的保護情況。
　　 4.在模型Ⅱ的基礎上給予梯度

4、濃度的rhFGF-21處理，之后收取細胞裂解液，用Western Blot檢測pAkt、pGSK-3β的表達情況;用選擇性Akt抑制劑API-2干擾Akt磷酸化，觀察其對rhFGF-21保護作用的影響。
　　 5.在模型Ⅱ的基礎上給予梯度濃度的rhFGF-21處理，之后收取細胞裂解液，經(jīng)前處理后使用2D-GE技術(shù)分離蛋白質(zhì)，應用2D-Master軟件分析差異斑點，對差異顯著的蛋白斑點進行質(zhì)譜鑒定，歸類分析。
　　 6.對

5、于蛋白質(zhì)組學分析出ATP合酶在rhFGF-21作用下發(fā)生了改變，考慮到rhFGF-21可能是對于細胞能量代謝進行了干預，因此我們進一步對各組能荷變化行實驗論證。
　　 結(jié)果：
　　 1.在細胞活性檢測實驗中，CCK-8檢測顯示，在模型Ⅰ組與模型Ⅱ組中，rhFGF-21處理組對比模型組細胞存活率均有顯著增加(P＜0.05)，且呈現(xiàn)量效關系。小劑量多次給藥實驗發(fā)現(xiàn)，量效關系的表象是由于rhFGF-21半衰期短（降解）造成的，

6、而rhFGF-21保護作用實質(zhì)上是時間依賴性效應，即一段時間內(nèi)保持rhFGF-21低濃度穩(wěn)定即可發(fā)揮保護作用。同時rhFGF-21各種劑量均不具有促H9c2細胞增殖作用(P＞0.05)，極高劑量(＞4μg/ml)可誘發(fā)細胞凋亡。
　　 2.抗凋亡相關實驗中，rhFGF-21可明顯抑制IR誘導的細胞形態(tài)變化;亦可減少凋亡引發(fā)的細胞核碎裂(P＜0.05);凋亡信號特異性蛋白Caspase-3在模型組中斷裂激活的量顯著升高，而給予rh

7、FGF-21處理后激活減少(P＜0.05)。
　　 3.抗氧化應激相關實驗中，rhFGF-21處理組中的超氧陰離子含量明顯少于模型組。在H2O2模擬氧化應激損傷實驗中，rhFGF-21也表現(xiàn)出顯著保護作用。此外，模型組中內(nèi)源性的rhFGF-21表達隨損傷的加劇而減少。
　　 4.pAkt以及下游GSK-3β的磷酸化水平在I/RI時顯著下降，rhFGF-21處理后其磷酸化水平得以恢復，而運用Akt抑制劑則可拮抗rhFGF-

8、21的保護作用。
　　 5.在蛋白質(zhì)組學研究中，通過2D-Master軟件對比分析找出了64個差異斑點，并對其中26個蛋白斑點進行了質(zhì)譜鑒定。之后依據(jù)蛋白質(zhì)在各組中的表達情況進行分類，重點討論了I/RI和rhFGF-21相關性的蛋白質(zhì)。
　　 6.蛋白質(zhì)組學研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，rhFGF-21處理后ATP合酶活力明顯恢復，因此對各組細胞能荷進行檢測，發(fā)現(xiàn)rhFGF-21可顯著恢復I/RI細胞的供能。
　　 結(jié)