TLR4基因啟動(dòng)子區(qū)SNPs及其與嚴(yán)重創(chuàng)傷病人預(yù)后的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、臨床流行病學(xué)資料統(tǒng)計(jì)顯示，膿毒癥是臨床危重病患者的一個(gè)重要死亡原因，革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要毒性成分-LPS是導(dǎo)致膿毒癥的主要致病因子之一。既往我們主要針對(duì)LPS受體在膿毒癥發(fā)病機(jī)理中的作用開展了大量探索性研究，現(xiàn)已明確TLR4/CD14/MD-2是機(jī)體識(shí)別LPS的關(guān)鍵模式受體，其中CD14/MD-2基因多態(tài)性在膿毒癥的易感性及嚴(yán)重創(chuàng)傷預(yù)后方面發(fā)揮了重要作用。TLR4是LPS激活細(xì)胞的重要參與分子，盡管有研究表明其基因編碼區(qū)(codi

2、ng sequence，CDS)及3’非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)基因多態(tài)性與膿毒癥易感性有關(guān)，但其啟動(dòng)子區(qū)SNPs在中國(guó)人群中的分布以及在嚴(yán)重創(chuàng)傷病人預(yù)后中的作用尚不清楚。為此，本研究用生物信息學(xué)方法篩選出TLR4基因啟動(dòng)子區(qū)可能影響靶基因表達(dá)的SNP位點(diǎn)，然后以中國(guó)重慶地區(qū)漢族人群為研究對(duì)象，采用RFLP法對(duì)SNP發(fā)生及分布頻率進(jìn)行檢測(cè)分析，通過(guò)構(gòu)建SNP位點(diǎn)不同等位基因啟動(dòng)子載體，以雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)

3、觀察SNP對(duì)TLR4基因啟動(dòng)子活性的影響，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同基因型個(gè)體TLR4蛋白的表達(dá)水平，并探討了不同等位基因個(gè)體全血對(duì)LPS刺激的反應(yīng)性差異，最后通過(guò)對(duì)臨床嚴(yán)重創(chuàng)傷病人標(biāo)本分析進(jìn)一步探討上述SNPs與嚴(yán)重創(chuàng)傷病人預(yù)后之間的關(guān)系。主要結(jié)果與結(jié)論如下： 1.生物信息學(xué)分析顯示，TLR4基因啟動(dòng)子區(qū)-300.bp內(nèi)有12個(gè)SNP位點(diǎn)，其中-2242 T→c、-1892 G→A和-1837 A→G三個(gè)SNP位點(diǎn)堿基變異可能影響T

4、LR4基因啟動(dòng)子區(qū)與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性。 2.對(duì)379名重慶地區(qū)漢族健康人群的SNP調(diào)查分析顯示，TLR4基因啟動(dòng)子區(qū)存在-2242 T→C、-1892 G→A和-1837 A→G堿基變異，發(fā)生頻率分別為43.27％、27.70％和42.75％，均為高頻SNP。 3.通過(guò)PCR和定點(diǎn)突變技術(shù)，構(gòu)建了含TLR4基因-2331～+14區(qū)域啟動(dòng)子及相應(yīng)單點(diǎn)及多點(diǎn)突變啟動(dòng)子質(zhì)粒?；瘜W(xué)發(fā)光分析顯示，-2242 C啟動(dòng)子活性明顯高于

5、-2242T啟動(dòng)子活性，而其它突變啟動(dòng)子活性無(wú)明顯差異。說(shuō)明-2242 T→C堿基變異可增強(qiáng)TLR4.基因啟動(dòng)子活性，有可能為功能性突變。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，正常對(duì)照組中三位點(diǎn)三種基因型粒細(xì)胞表達(dá)TLR4均無(wú)顯著性差異：LPS刺激組中-2242位點(diǎn)CC純合子和TC雜合子TLR4蛋白表達(dá)水平均顯著高于TT純合子，而-1892和-1837位點(diǎn)則無(wú)顯著性差異，進(jìn)一步說(shuō)明-2242 T→C堿基變異可通過(guò)影響基因啟動(dòng)子活性增強(qiáng)靶基因的表達(dá)。

6、 4.以LPS刺激不同基因型個(gè)體全血，-2242 CC基因型個(gè)體TNFα、IL-6和IL-8產(chǎn)生水平均最高，TC基因型次之，而TT基因型細(xì)胞因子產(chǎn)生水平最低，提示-2242T→C堿基變異能顯著增強(qiáng)個(gè)體對(duì)內(nèi)毒素的反應(yīng)性。說(shuō)明該SNP對(duì)于臨床膿毒癥及其它炎癥疾病易感性的判定具有重要意義。 5.通過(guò)對(duì)153例嚴(yán)重創(chuàng)傷病人針對(duì)-2242位點(diǎn)基因分型及臨床資料分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了含TLR4基因5’啟動(dòng)子區(qū)-2242 C等位基因的個(gè)體在