電刺激調控膠質細胞活性促進光損傷感光細胞存活的實驗研究.pdf

1、第一部分：電刺激促進光損傷感光細胞存活的神經保護作用
　　 體外培養(yǎng)感光細胞系(661W)，接種于六孔板貼壁后，放入光照培養(yǎng)箱中接受4～6 h光照強度為15，000 lux的寬譜藍光照射。在光照后的24 h進行LDH細胞壞死測定實驗、TUNEL凋亡染色及免疫熒光染色觀察661W的凋亡情況以及形態(tài)學改變。結果顯示：光照后，LDH實驗顯示59.7％±2.7％的661W細胞壞死，TUNEL顯示70％左右的染色陽性即凋亡，而免疫熒光染色

2、則發(fā)現正常661W呈扁平狀，細胞之間連接緊密，但光損傷后661W突觸變細長，細胞失去扁平形態(tài)，且細胞間隙明顯變大，表明光損傷誘導感光細胞凋亡模型成功建立。
　　 利用1 h雙相方波、直流電刺激(3 ms，20 Hz，300～1600μ A)預先作用于光損傷661W和小膠質細胞或Müller細胞共培養(yǎng)體系，并將其視為干預組；將未接受電刺激的此共培養(yǎng)體系視為未干預對照組；正常661W細胞和小膠質細胞或Müller細胞共培養(yǎng)體系視為正

3、常對照組。在共培養(yǎng)后3 h、6 h、12 h、24 h進行LDH實驗，并在共培養(yǎng)后24 h進行TUNEL凋亡染色實驗及免疫熒光染色。結果如下：LDH凋亡一時間曲線表明1000μA的電刺激預先作用于光損傷661W和小膠質細胞共培養(yǎng)組之后，相較于未干預組相對應時間點的細胞死亡率，從共培養(yǎng)后12 h開始661W的細胞死亡率顯著降低，并保持相對恒定直到共培養(yǎng)后24 h；同樣，1600μA的電刺激預先作用于光損傷661W和Müller細胞共培養(yǎng)組

4、之后，從共培養(yǎng)后3 h開始661W的細胞死亡率顯著降低，并逐漸加大降低幅度直到共培養(yǎng)后24 h。TUNEL染色則顯示共培養(yǎng)后24 h，電刺激干預組的TUNEL染色陽性細胞比率較未干預組明顯減少。免疫熒光染色也提示了光損傷661W細胞和小膠質細胞干預組的661W較未干預組細胞形態(tài)改變程度輕，細胞間隙更小。另一方面，我們也將電刺激總用于光損傷后單獨培養(yǎng)的661W細胞，并在相同時間節(jié)點進行LDH、TUNEL及免疫熒光染色實驗，但結果與作用于共

5、培養(yǎng)體系的電刺激不同，電刺激干預并未減輕661W細胞的凋亡。
　　 本部分的實驗研究結果表明，電刺激能夠減輕強光照射引起的感光細胞凋亡變性，但感光細胞本身對電刺激并沒有反應，可能電刺激改變了膠質細胞的活性，而膠質細胞活性的改變轉而影響了感光細胞的存活。
　　 第二部分：光損傷誘導感光細胞變性激活視網膜膠質細胞，激活的膠質細胞進而影響光損傷感光細胞凋亡的作用
　　 成功建立了光損傷誘導感光細胞變性的模型后，我們進一

6、步利用膠質細胞與光損傷感光細胞共培養(yǎng)體系(未干預組)探索小膠質細胞和Müller細胞受光損傷感光細胞影響后的數量、形態(tài)學的改變以及相伴隨的功能的變化，同時探索平行的661W細胞的生存狀態(tài)變化。正常661W細胞和小膠質細胞或Müller細胞共培養(yǎng)組視為正常對照組。在共培養(yǎng)24 h后利用免疫熒光染色觀察兩組小膠質細胞或Müller細胞數量及形態(tài)學的差異；同時利用Real-time PCR和Western blot法在共培養(yǎng)后3 h，6 h，

7、12 h，24 h對兩組小膠質細胞所分泌的促炎因子IL－1β、TNF-α以及Müller細胞所分泌的神經營養(yǎng)因子BDNF、CNTF的基因表達量和蛋白分泌量兩組差異以及時間趨勢變化進行定量分析。并且運用LDH、TUNEL及免疫熒光染色等實驗檢測單獨培養(yǎng)光損傷661W細胞和與小膠質細胞或Müller細胞共培養(yǎng)的661W細胞壞死和凋亡率的差異。
　　 結果顯示：免疫細胞化學實驗發(fā)現與正常661W細胞共培養(yǎng)的小膠質細胞成靜息狀態(tài)，形態(tài)成

8、分支狀，突觸長，胞體較小，而與光損傷661W細胞共培養(yǎng)的小膠質細胞成激活狀態(tài)，形態(tài)成阿米巴樣或圓形，突觸短，胞體大，且數量較正常對照組增多。兩組Müller細胞的形態(tài)則無顯著差異。另外，在共培養(yǎng)后的24 h，Real-time PCR和Western blot顯示與光損傷661W共培養(yǎng)的小膠質細胞IL-1β和TNF-α的基因和蛋白表達量較正常對照組顯著上升，與光損傷661W共培養(yǎng)的Müller細胞BDNF和CNTF的基因和蛋白表達量也較

9、正常對照組明顯上調；蛋白量-時間趨勢曲線則發(fā)現在正常對照組中，小膠質細胞分泌的IL-1β和TNF-α在共培養(yǎng)后3 h至24 h時間段內基本保持穩(wěn)定且較低的水平。而相反的，與光損傷661W共培養(yǎng)的小膠質細胞分泌的IL-1β蛋白量則隨著時間進展逐步升高，在共培養(yǎng)后24 h達到最高峰；同樣，其所分泌的TNF-α蛋白量也隨著時間上調，在共培養(yǎng)后12 h達到最高峰，之后到24 h時間段內略微下降。另一方面，正常對照組中的Müller細胞分泌的BD

10、NF、CNTF蛋白量-時間曲線顯示BDNF蛋白量隨時間呈現逐漸衰減的趨勢，而CNTF則相對保持穩(wěn)定。然而與光損傷661W共培養(yǎng)的Müller細胞分泌的BDNF蛋白量迅速上調，在共培養(yǎng)后的6 h達到最高峰，之后略有下降；其所分泌的CNTF則逐步平穩(wěn)上升。LDH、TUNEL等實驗結果顯示相較單獨培養(yǎng)的光損傷661W細胞，與小膠質細胞共培養(yǎng)的光損傷661W細胞的壞死率隨著時間進展顯著上升；而與Müller細胞共培養(yǎng)的光損傷661W細胞的壞死率

11、則明顯減低。
　　 本部分的實驗研究發(fā)現光損傷誘導的感光細胞凋亡引發(fā)了小膠質細胞的激活和Müller細胞的反應性膠質化，并伴隨著小膠質細胞分泌的促炎因子IL-1β和TNF-α和Müller細胞分泌的神經營養(yǎng)因子BDNF、CNTF的上調，并且小膠質細胞的激活加重了661W細胞的損傷，而Müller細胞的反應性膠質化則減輕了661W細胞的凋亡，表明了膠質細胞活性改變在光損傷誘導感光細胞變性過程起著重要的作用。
　　 第三部分

12、：電刺激干預光損傷感光細胞凋亡誘導的膠質細胞激活的作用
　　 將1 h雙相方波、直流電刺激(3 ms，20 Hz，300～1600μ A)預先作用于光損傷661W和小膠質細胞或Müller細胞共培養(yǎng)體系，視為干預組；將未接受電刺激的此共培養(yǎng)體系視為未干預對照組；正常661W細胞和小膠質細胞或Müller細胞共培養(yǎng)體系視為正常對照組。采用免疫熒光染色在共培養(yǎng)24 h后觀察各組小膠質細胞及Müller細胞形態(tài)學、數量的差異；利用Re

13、al-time PCR和Westernblot法在共培養(yǎng)后3 h，6 h，12 h，24 h對各組小膠質細胞所分泌的促炎因子IL-1β、TNF-α以及Müller細胞所分泌的神經營養(yǎng)因子BDNF、CNTF的基因表達量和蛋白分泌量兩組差異以及時間趨勢變化進行定量分析。
　　 結果顯示：免疫學熒光染色顯示的未干預對照組和正常對照組間的小膠質細胞和Müller細胞形態(tài)學差別如第一部分所述，電刺激干預組的小膠質細胞的阿米巴樣的活化數量則

14、較干預組明顯減少，并且一部分細胞雖然沒有出現像靜息狀態(tài)時的明顯的分支狀，但胞體呈扁平狀態(tài)，我們將其視作“中間狀態(tài)”；而電刺激干預組的Müller細胞則較未干預對照組和正常對照組的Müller細胞顯得胞體更大，胞體內纖維組織更豐富，且細胞數量也明顯增多。伴隨著形態(tài)學的改變，Real-time PCR和Western blot結果顯示電刺激干預組中的小膠質細胞IL-1β和TNF-α的基因和蛋白表達量較未干預組顯著降低，Müller細胞BDN

15、F和CNTF的基因和蛋白表達量較未干預組進一步升高；蛋白量-時間趨勢曲線則顯示電刺激干預抑制了未干預組中小膠質細胞IL-1β和TNF-α持續(xù)升高，分別在共培養(yǎng)后24 h和12 h降至最低最低點；而電刺激干預組中Müller細胞分泌的BDNF蛋白量較未干預組隨時間上升幅度進一步加大；CNTF的分泌高峰則被提前至共培養(yǎng)后6 h，上升幅度增大并保持至共培養(yǎng)后24 h。
　　 這部分實驗結果表明：電刺激能夠有效抑制由光損傷感光細胞誘導的