電刺激聯(lián)合Nurr-1基因促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的神經(jīng)分化.pdf

1、脊髓損傷可以造成病灶區(qū)域大量神經(jīng)元受損或死亡。以往的研究采用藥物,手術(shù)等治療方法,效果均不太理想[3-5]。目前,應(yīng)用干細(xì)胞的方法治療神經(jīng)損傷被廣泛應(yīng)用于各項(xiàng)研究[6-8]。在各種類型的干細(xì)胞中,ADSCs以其來源豐富、取材容易、分化能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)受到越來越多的重視。但因其自發(fā)向神經(jīng)方向分化的能力較低,因此,尋找一種能夠促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)方向分化的方法,用以治療神經(jīng)損傷,將具有重大意義。
　　Nurr-1是孤兒核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族

2、的一員,能影響胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化,尤其對中腦多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和存活有著重要的意義,能促進(jìn)其發(fā)育、成熟、遷移、分化[11-13]。研究表明,Nurr-1基因在多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育分化過程中起關(guān)鍵作用,而這種作用與細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶信號通路有關(guān)[14]。實(shí)驗(yàn)證實(shí),在胚胎前體細(xì)胞中過表達(dá)Nurr-1基因能促進(jìn)其向神經(jīng)元方向分化,并抑制其向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化[15]。此外,對骨髓干細(xì)胞進(jìn)行Nurr-1基因轉(zhuǎn)染,也能促進(jìn)其向神經(jīng)方向分化。綜上所述

3、,Nurr-1基因具有促進(jìn)胚胎前體細(xì)胞與 BMSCs的神經(jīng)分化作用,但Nurr-1基因?qū)DSCs向神經(jīng)分化的作用尚未有文獻(xiàn)報道。
　　神經(jīng)細(xì)胞是電興奮細(xì)胞,有研究證實(shí)電刺激能促進(jìn)神經(jīng)分化早期中軸突的生長[18,19]。近年來,電刺激對干細(xì)胞分化的影響受到越來越多科學(xué)家的重視。研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)電刺激強(qiáng)度為10V時,能促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)方向分化[20],同時電刺激對骨髓干細(xì)胞也有類似的促神經(jīng)分化作用[16]。這些研究表明電刺激在干細(xì)胞

4、的神經(jīng)分化過程中起著重要的作用。最新研究表明,低頻交流電能夠提高脂肪干細(xì)胞胞漿內(nèi)的鈣離子濃度[21],但電刺激對脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)方向分化的作用鮮有研究。有文獻(xiàn)證實(shí),適宜的電刺激能促進(jìn)嗅鞘細(xì)胞和雪旺細(xì)胞的增殖活性[22,23],但電刺激對脂肪干細(xì)胞的增殖,凋亡等活性影響尚未研究。本課題主要研究電刺激與Nurr-1基因?qū)χ靖杉?xì)胞的神經(jīng)分化的影響,為脂肪干細(xì)胞的神經(jīng)分化提供新的思路。
　　實(shí)驗(yàn)一:Nurr-1基因轉(zhuǎn)染對脂肪干細(xì)胞神經(jīng)分

5、化的影響
　　目的:
　　研究孤兒核受體相關(guān)基因1(Nurr-1)對脂肪干細(xì)胞(adipose tissue-derived stem cells,ADSC)向神經(jīng)元方向分化的作用。
　　方法:
　　采用貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)ADSCs,對第三代細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞CD29、CD44、CD45、CD90的分子鑒定與成骨和成脂誘導(dǎo)分化鑒定;采用慢病毒作為載體,將Nurrr-1基因轉(zhuǎn)染進(jìn)脂肪干細(xì)胞,使其得到穩(wěn)定表達(dá),經(jīng)培養(yǎng)后

6、對細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)特異性標(biāo)志物MAP-2,β-tubulin的免疫熒光染色和蛋白檢測,同時,對MAP-2、β-tubulin、NF-200進(jìn)行基因?qū)用娴臋z測,用以評估其向神經(jīng)方向分化的能力,并檢測其分化率。
　　結(jié)果:
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,經(jīng)過培養(yǎng)三代的細(xì)胞的CD29,CD44表達(dá)均在90％以上,CD45,CD90表達(dá)均低于1.5%,經(jīng)過誘導(dǎo)后,對其進(jìn)行油紅O、茜素紅S染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組均呈陽性,鏡下分別觀察到脂滴和鈣結(jié)節(jié)形

7、成。表明所培養(yǎng)的細(xì)胞為脂肪干細(xì)胞;慢病毒轉(zhuǎn)染Nurr-1基因后,免疫熒光染色檢測MAP-2,β-tubulin的免疫熒光強(qiáng)度顯著增加。蛋白檢測也證實(shí)在Nurr-1轉(zhuǎn)染組,MAP-2,β-tubulin的蛋白表達(dá)量得到明顯提升;RT-PCR結(jié)果顯示Nurr-1轉(zhuǎn)染的脂肪干細(xì)胞中MAP-2、β-tubulin、NF-200的表達(dá)量顯著提高。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)采用的方法能培養(yǎng)出純度很高的脂肪干細(xì)胞;Nurr-1基因轉(zhuǎn)染脂肪干

8、細(xì)胞,能促進(jìn)其向神經(jīng)方向分化。
　　實(shí)驗(yàn)二:電刺激對脂肪干細(xì)胞神經(jīng)分化的影響
　　目的:
　　研究了不同強(qiáng)度下的電刺激作用于脂肪干細(xì)胞,對其增殖,凋亡及向神經(jīng)方向分化的影響作用,同時篩選出最佳的電刺激強(qiáng)度。
　　方法:
　　實(shí)驗(yàn)分為0、0.5、1.0、3.0、5.0 V/cm五組;對實(shí)驗(yàn)各組進(jìn)行相應(yīng)的電刺激后,對各組細(xì)胞進(jìn)行流式凋亡檢測、CCK-8活性檢測,用以篩選最適宜脂肪干細(xì)胞的刺激強(qiáng)度;對電刺激后的實(shí)

9、驗(yàn)各組細(xì)胞進(jìn)行神經(jīng)特異性標(biāo)志物MAP-2,β-tubulin的免疫熒光檢測,蛋白檢測,同時對不同組進(jìn)行MAP-2,β-tubulin和NF-200的基因檢測,用于評估不同電刺激強(qiáng)度下其向神經(jīng)方向分化的能力。
　　結(jié)果:
　　流式凋亡結(jié)果和CCK-8檢測結(jié)果表明在1V/cm組電刺激下,沒有引起明顯的細(xì)胞凋亡,而且促進(jìn)了細(xì)胞的增殖。經(jīng)過免疫熒光染色,蛋白檢測,1V/cm組中細(xì)胞的MAP-2和β-tubulin的免疫熒光呈陽性表達(dá)

10、,同時蛋白表達(dá)顯著增加;RT-PCR檢測顯示MAP-2,β-tubulin和NF-200的表達(dá)量顯著提高。
　　結(jié)論:
　　強(qiáng)度為1V/cm的電刺激可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)其向神經(jīng)方向化,為神經(jīng)損傷的治療提供了新的可行方法。
　　實(shí)驗(yàn)三:電刺激聯(lián)合Nurr-1基因轉(zhuǎn)染作用于脂肪干細(xì)胞,對脂肪干細(xì)胞神經(jīng)分化的影響
　　目的:
　　將孤兒核受體相關(guān)基因1(Nurr-1)和電刺激聯(lián)合作用于脂肪干細(xì)胞,觀察這

11、種方法對ADSCs向神經(jīng)元方向分化的潛在作用。
　　方法:
　　將實(shí)驗(yàn)分為四組:對照組、電刺激組、Nurr-1基因轉(zhuǎn)染組、電刺激聯(lián)合Nurr-1基因轉(zhuǎn)染組。應(yīng)用神經(jīng)特異性標(biāo)志物MAP-2,β-tubulin的免疫熒光染色評估其向神經(jīng)方向分化的能力,并測量各組細(xì)胞的突起長度(Image-Pro Plus6.0軟件)。對MAP-2,β-tubulin進(jìn)行蛋白定量檢測,對MAP-2、β-tubulin、OCT-4、GFAP和NF-

12、200進(jìn)行基因水平檢測,掃描電鏡觀察實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞形態(tài)。
　　結(jié)果:
　　免疫熒光結(jié)果顯示,對照組中MAP-2和β-tubulin幾乎沒有陽性表達(dá),電刺激組,Nurr-1基因轉(zhuǎn)染組和電刺激聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組均有有陽性表達(dá),且電刺激聯(lián)合 Nurr-1基因轉(zhuǎn)染組的MAP-2和β-tubulin的陽性率在這三組中表現(xiàn)最高。分別為MAP-2陽性率:22.10±2.01%,β-tubulin陽性率:66.12±5.03%。分別對各組染色細(xì)胞

13、進(jìn)行突起長度測量發(fā)現(xiàn),對照組的長度為11.8±5.3μm,電刺激組長度為74.1±7.8μm,基因轉(zhuǎn)染組突起長度為61.2±7.1μm,電刺激聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組的突起長度為174±8.7μm。蛋白檢測顯示,相比對照組,其他各組的MAP-2與β-tubulin蛋白表達(dá)均有顯著提升;且電刺激聯(lián)合Nurr-1基因轉(zhuǎn)染組的蛋白表達(dá)量與電刺激組和基因轉(zhuǎn)染組相比也有明顯升高?；驒z測顯示,MAP-2,β-tubulin和NF-200的表達(dá)在電刺激組,N

14、urr-1基因轉(zhuǎn)染組,電刺激聯(lián)合基因轉(zhuǎn)染組均升高,其中電刺激聯(lián)合Nurr-1基因轉(zhuǎn)染組升高最為顯著。OCT-4與GFAP的表達(dá)在這三組中均下降,其中電刺激聯(lián)合Nurr-1基因轉(zhuǎn)染組的表達(dá)下降最明顯。對實(shí)驗(yàn)各組進(jìn)行掃描電鏡觀察,發(fā)現(xiàn)對照組細(xì)胞貼壁,胞質(zhì)擴(kuò)散、平鋪,呈多邊形。電刺激組細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞拉長,呈兩極或多極狀?；蜣D(zhuǎn)染組細(xì)胞胞質(zhì)回縮,呈球形,折光性增強(qiáng)。電刺激聯(lián)合Nurr-1轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞胞質(zhì)明顯回縮,胞漿變長呈類軸突狀,折光性較強(qiáng)。<